蒺藜皂苷对老年痴呆小鼠脑组织中H2 O2、CAT、GSH-Px含量及海马超微结构的影响

张 季 严春临 张丹参 张 力 安 芳 侯 勇 (河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

蒺藜皂苷对老年痴呆小鼠脑组织中H2O2、CAT、GSH-Px含量及海马超微结构的影响

张 季 严春临 张丹参 张 力 安 芳 侯 勇 (河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

目的 研究蒺藜皂苷对凝聚态β-淀粉样肽(Aβ25～35)致衰老小鼠脑组织中过氧化氢(H2O2)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)含量及海马超微结构的影响。方法 采用一次性小鼠右侧脑室注射Aβ25～353μl造成AD小鼠模型，并于侧脑室注射后14 d测定各组小鼠脑组织中H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力并于光镜、电镜下观察小鼠大脑皮质及海马组织超微结构。结果 侧脑室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠脑组织内H2O2含量增加，同时使小鼠脑组织内CAT和GSH-Px活力显著降低，而连续蒺藜皂苷14 d治疗后，与模型组相比蒺藜皂苷150 mg/kg治疗组可显著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，蒺藜皂苷450 mg/kg治疗组可显著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01);光镜下观察结果显示正常对照组海马CA1区神经元密集、神经元结构正常;模型组神经元间隙加大，说明有轻度水肿，部分神经元核、质界限模糊，细胞嗜酸性增强;电镜下观察结果显示正常对照组神经元、神经纤维超微结构正常;模型组神经元轻度水肿，脂褐素样包含物增多，线粒体减少或消失;蒺藜皂苷各治疗组可不同程度的减轻上述病理学改变。结论 侧脑室注射Aβ25～35可引起小鼠大脑自由基增加，海马超微结构改变，蒺藜皂苷能明显改善衰老小鼠大脑组织的超微结构并呈剂量效应关系。

蒺藜皂苷;阿尔茨海默病;β-淀粉样肽;自由基;超微结构

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为大脑萎缩、脑组织内出现老年斑(SP)、脑血管沉淀物、神经元纤维缠结(NFT)和神经元的丢失〔1〕。近年，越来越多的研究发现β-淀粉样肽(Aβ)在脑内沉积形成SP是AD的发病基础〔2〕。蒺藜皂苷(GSTT)是蒺藜果实中提取的甾体皂苷的总称，GSTT具有治疗心脑血管疾病、增强性功能、清除自由基等作用〔3，4〕。近期研究表明 GSTT 对 Aβ25～35所导致痴呆小鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用〔5〕，GSTT是否通过清除痴呆小鼠脑内多余自由基起作用，是否能改善痴呆小鼠海马组织超微结构病变目前均尚未见报道。本研究采用一次性在小鼠右侧脑室注射3μl Aβ25～35造成AD小鼠模型，观察痴呆小鼠脑内自由基的变化及海马神经元超微结构的改变，初步探讨GSTT治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康、昆明种雄性小鼠，体重(28±2)g，由中国医学科学院实验动物中心提供。全部动物在实验室适应性饲养3 d后用于实验，分笼饲养，自由饮食和饮水。室温(20±2)℃。

1.1.2 药品与试剂 GSTT购自西安天一生物技术有限公司，批号T20060901，含量90.12%，GSTT为棕黄色粉末，可溶于水，用前用蒸馏水配制成所需浓度。Aβ25～35购自美国Sigma公司，批号 29H49501，凝聚态 Aβ25～35的制备:将 1.0 mg Aβ25～35溶解于1.0 ml的无菌生理盐水中(1.0 mmol/L)，密封后置于37℃培养箱中孵育1 w，使其成凝聚态，于 －20℃保存，备用〔6，7〕。过氧化氢酶(CAT)试剂盒、过氧化氢(H2O2)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。戊二醛、锇酸、环氧树脂(Epon-812)、甲基钠迪克酸酐(MNA)等均为化学纯。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 昆明种雄性小鼠75只，随机为5组，分别为生理盐水对照组(正常对照组);Aβ(模型组);GSTT 50、150和450 mg/kg组。模型组和GSTT各治疗组于小鼠右侧脑室一次性注射Aβ25～353.0μl(3 nmol)，正常对照组注入等量生理盐水〔8，9〕。于造模后1 h给药，GSTT各治疗组腹腔注射相应剂量的GSTT(0.1 m l/10 g);正常对照组及模型组0.1 m l/10 g生理盐水(NS)，每日1次，共14 d。

1.2.2 小鼠脑组织生化指标的测定 第14天给药后1 h将小鼠迅速断头处死，取脑，制成10%脑匀浆，然后将制备好的脑匀浆以3 000 r/min离心10 min，取上清液适量，按照试剂盒说明书分别测定H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力，采用考马斯亮蓝法测定脑组织蛋白含量。

1.2.3 病理实验 另取50只健康、昆明种雄性小鼠，体重(28±2)g，分组、给药同前，第14天给药后1 h将小鼠快速断头处死，在生理盐水冰块上迅速打开颅骨取脑，将脑膜和小脑剥离，保留大脑，用冷生理盐水冲洗，用于光镜和电镜观察。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS13.0统计软件进行处理，结果以±s表示，组间显著性差异采用单因素方差检验。

2 结果

2.1 GSTT对 Aβ25～35所致小鼠脑组织 H2O2含量、CAT和GSH-Px活力的影响 侧脑室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠脑组织内H2O2含量增加，同时使小鼠脑组织内CAT和GSH-Px活力显著降低，而连续GSTT 14 d治疗后，与模型组相比GSTT 50 mg/kg降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性无显著性差异(P＞0.05)。GSTT 150 mg/kg治疗组可显著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，GSTT 450mg/kg治疗组可显著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01)。见表1。

2.2 GSTT对Aβ25～35所致小鼠脑组织神经病理形态的影响光镜观察石蜡切片HE染色正常对照组海马CA1区神经元密集，由4～6层神经细胞组成，神经元核圆形，核仁大而清晰，异染色质少，胞质较少，突起不明显;模型组神经元间隙加大，说明有轻度水肿，部分神经元核、质界限模糊，细胞嗜酸性增强;GSTT各治疗组神经元水肿减轻，细胞边界清晰。见图1。

电镜观察正常对照组神经元核大、圆，核仁多，核膜清晰，核间隙均匀，异染色质少，常染色质呈絮状，胞质中有丰富的线粒体、粗面内质网、核糖体等，未见脂褐素样次级溶酶体，有髓神经纤维，髓鞘结构清晰;模型组神经元轻度水肿，局部质膜消失，核内异染色质相对增多，核仁少，电子密度降低，胞质中细胞器减少，内质网扩张呈不规则泡状，脂褐素样包含物增多，线粒体减少或消失;GSTT 50 mg/kg治疗组细胞核有不规则的凹陷，胞质中细胞器增多，脂褐素仍较常见;GSTT 150 mg/kg治疗组核仁可见，核边界稍有不规则，细胞器增多;GSTT 450 mg/kg治疗组神经元核大、圆，核仁明显，边界清晰，细胞器丰富，线粒体、粗面内质网、核糖体均可见到，有的细胞中仍有脂褐素颗粒，神经纤维结构正常。见图2。

图1 光镜下，各组的超微结构(HE染色，×100)

图2 电镜下，各组的超微结构(釉-铅染色，×10 000)

表1 GSTT对Aβ25～35模型小鼠脑组织H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影响(±s，n=15)

表1 GSTT对Aβ25～35模型小鼠脑组织H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影响(±s，n=15)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 剂量(mg/kg)H2O2(mmol/L)CAT(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)正常对照组1.03±0.24 6.15±1.26 31.51±5.72模型组 1.33±0.251) 4.58±1.171) 22.77±5.641)GSTT组 50 1.23±0.18 4.64±1.32 24.28±4.77 GSTT组 150 1.14±0.212) 5.49±1.192) 27.33±5.732)GSTT组 450 1.09±0.193) 5.88±1.213) 29.36±5.583)

3 讨论

AD最主要的病理改变为SP和NFT，神经细胞淀粉样前体蛋白(APP)可在γ-分泌酶作用下裂解产生Aβ，Aβ是引起脑组织形成不溶性淀粉样沉积的重要物质，也是脑组织淀粉样斑块中的主要成分，侧脑室内一次性注射可溶性大片段Aβ可部分的模拟出AD临床表现〔7〕。Aβ增高不但能引起斑块沉积，Aβ亦具很强的阳性物质还原作用，可迅速还原Ca2+和Fe2+，捕获分子氧，产生H2O2，导致氧化应激反应，使超氧化物歧化酶(SOD)降低，丙二醛(MDA)上调，诱导神经细胞的凋亡或死亡〔8〕。过氧化物又可使溶解状态下Aβ的转化为聚集态的Aβ，加速脑内的沉积和缠结，从而形成恶性循环〔9〕。本实验结果表明模型组AD小鼠脑组织内H2O2含量明显升高，对小鼠造成一定的损伤，而GSTT可有效对抗小鼠脑内H2O2升高，其机制可能与GSTT减少淀粉样沉积、加速斑块的清除、提高AD小鼠脑内各种过氧化物酶(如CAT、GSH-Px)的活力，降低小鼠脑内各种自由基，从而减少Aβ25～35所诱导的自由基损伤和细胞毒作用有关有关，GSTT对AD小鼠的保护作用是否与其他过氧化物酶活力提高有关，还有待进一步研究。本实验还观察到:GSTT 50 mg/kg和150 mg/kg剂量组对海马神经细胞超微结构的保护作用均不明显;GSTT 450 mg/kg组对海马超微结构显示出明显的保护作用。GSTT各组随剂量增加，对海马超微结构的保护作用增强。因此GSTT能保护Aβ老化模型小鼠海马超微结构的正常，其作用可能通过清除自由基或增强自由基清除酶的活性，抑制膜脂质过氧化机制起到保护海马神经细胞超微结构的作用，从而达到延缓衰老和防治老年性痴呆，因此GSTT有可能成为治疗AD的一种新药，有广泛的应用前景。

1 王德生，张守信.老年性痴呆〔M〕.北京:人民卫生出版社，2001:397.

2 邓海平，沈雪勇，丁光宏.Alzheimer病β-淀粉样蛋白神经毒性机制的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2004;24(1):73-4.

3 李 穆，褚书地，瞿伟菁，等.蒺藜化学成分及其药理作用研究进展〔J〕.中国野生植物资源，2003;22(4):4-7.

4 孙少敏，张维君，杨晶，等.刺蒺藜对衰老小鼠的红细胞SOD活性和MDA含量的影响〔J〕.黑龙江医药科学，2000;23(1):5.

5 张 季，张丹参，严春临，等.蒺藜皂苷对小鼠记忆障碍的影响〔J〕.中药药理与临床，2007;23(3):47-9.

6 徐淑云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京:人民卫生出版社，2005:184.

7 楚 晋，李 林.脑室灌注β淀粉样肽致痴呆动物模型〔J〕.中国药理学通报，2004;20(7):827-9.

8 张孟仁，郭赛珊，左萍萍，等.β淀粉样肽损伤后小鼠脑单胺氧化酶B、白细胞介素-6的变化及中药的干预作用〔J〕.中国康复理论与实践，2005;11(5):327-9.

9 Huang X，Atwood CS，Hartshorn MA，et al.The beta-peptide of Alzheimer's disease directly produces hydrogen peroxide through metal ion reduction〔J〕.Biochemistry，1999;38(24):7609-16.

R965.1

A

1005-9202(2011)12-2258-03

张丹参(1961-)，女，教授，博士生导师，主要从事神经药理学研究。

张 季(1978-)，女，硕士，讲师，主要从事中药药理学研究。

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〔2010-06-29收稿 2011-01-04修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)