20(S)-原人参二醇对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

冷吉燕 李丽新 张 婧 秦俊杰 (吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

20(S)-原人参二醇对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

冷吉燕 李丽新 张 婧 秦俊杰 (吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

目的 探讨20(S)-原人参二醇(Ppd)对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的影响。方法 采用MTT法检测Ppd对SGC-7901细胞存活率的影响，流式细胞分析法检测凋亡小体的含量。结果 Ppd对SGC-7901细胞生长有明显的抑制作用，且呈量-效关系;IC50为2.0μg/ml;且肿瘤细胞产生明显的G1期阻滞现象，Ppd 2.0μg/ml时G1细胞百分率达76.08%，而在Ppd 10.0μg/ml时为81.17%，较对照组(39.02%)明显增多(P＜0.05)，而S、G2～M期细胞数明显减少。流式细胞术结果也证明，不同浓度的Ppd作用SGC-7901细胞后，在G1期的前面出现一个小的亚二倍体峰，即为凋亡峰，且随着Ppd剂量增加，处于凋亡峰的细胞比例呈增加趋势。在Ppd 2.0μg/ml时，其凋亡峰为27.58;Ppd 10.0μg/ml时，出现最大凋亡峰为28.31。结论 Ppd促进了胃癌SGC-7901细胞凋亡，抑制了胃癌SGC-7901细胞的增殖。

Ppd;胃癌;细胞凋亡;SGC-7901

20(S)-原人参二醇(Ppd)从人参、西洋参中提纯，通过体内试验、增效减毒试验、肿瘤免疫学试验及分子生物学试验证实，Ppd具有良好的抗癌活性，对肝癌H22、Lewis肺癌及黑色素瘤B16均具有明显的生长抑制作用，并可增强机体免疫力，具有提高自然杀伤细胞(NK)、白细胞介素-2(IL-2)活性的作用，但目前关于Ppd对人胃癌细胞的作用研究较少。本文旨在研究Ppd对伴有淋巴结转移的人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SGC-7901购自中国医学科学院基础医学研究所，噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司;IMDM人工合成培养液，GIBCOBRL;新生牛血清，Hyclone产品;Ppd由本校有机化学教研室提供。RNA酶，Bochringe Mannheim产品;碘化丙锭(PI)，SIGMA U.S.A;流式细胞仪(ELITE型)，Coulter U.S.;AMikro 22R高速低温离心机，Zentrifugen Germany。

1.2 细胞培养及细胞存活率的监测 细胞传代培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2孵箱，生长至对数生长期，以浓度为5×104个/m l，接种于96孔培养板，培养24 h 后，分为5 组，分别加入0.5、1.0、2、5、10 μg/ml浓度的Ppd溶液，100μl/孔，另设磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照组，各浓度设8个复孔，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/m l的MTT 20μl，培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔，振荡15 min，在酶联仪波长550 nm处测出各孔吸光度值(A)。实验重复3次，按下列公式计算细胞生长抑制率:抑制率(%)=(1－加药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%，计算IC50。

1.3 细胞凋亡的检测 25%胰酶消化传代贴壁细胞、计数，台盼蓝染色测活细胞数为90%以上，将细胞接种于培养瓶中，每瓶5×106，同时加药，根据Ppd浓度分为5组，分别为0.5、1.0、2、5、10 μg/m l，对照组加等体积 PBS，各浓度设 6 个复孔，每瓶终体积为4 ml，作用48 h后，收集经药物作用后的各浓度的细胞1×106个，离心，弃上清，将细胞团吹打均匀后用70%冷乙醇4℃固定12 h以上。PBS洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml。加入RNAase 0.5ml(5 μg/ml)，37℃消化30min，取出放入冰浴中，加入1.5 m l PI 1.5 ml(5 mg/100 ml)对DNA进行染色，用300目尼龙网过滤。上流式细胞仪，在波长为488 nm、300 mV氩离子激光条件下，每份样品检测1×104/m l个细胞。所得数据通过接口直接贮存在计算机上，用multicycle进行分析，以DNA含量为横坐标，受检细胞数为纵坐标，计算各期细胞所占比例。

1.4 统计学分析 所有数据的统计分析均在SPSS及MSExcel中进行，采用方差分析和重复测量的方差分析。

2 结果

2.1 Ppd对SGC-7901的抑制作用 从2.0μg/m l起，Ppd即对SGC-7901生长具有明显的抑制作用，最大抑制率达到58.9%。随着Ppd浓度的增高，对SGC-7901的抑制作用也增强，呈剂量依赖性，但增长幅度近于平台表现。故以下均以Ppd 2.0μg/ml作为最佳抗肿瘤剂量进行实验。见表1。

表1 Ppd对SGC-7901细胞的抑制作用(n=8)

2.2 Ppd作用后SGC-7901细胞的形态学变化 将SGC-7901细胞与不同剂量的Ppd共同孵育48 h后，光镜下观察，未给药组细胞贴壁状况良好，细胞透明，状态佳，细胞折光性好，细胞呈棱形或多角形，铺满整个瓶壁。Ppd给药组，低剂量组细胞形态不规则，细胞体积减小，细胞数目较对照组少，胞质无明显变化。高剂量组细胞贴壁状况不好，大部分贴壁细胞为圆形，细胞内有较多颗粒样物质，部分细胞漂浮在培养液中，细胞数目较低剂量组明显减少。

2.3 Ppd对SGC-7901细胞周期的影响 流式细胞仪检查结果表明，用不同浓度的Ppd处理细胞48 h后，S、G2～M期细胞数减少，G1期细胞数明显增多。见表2。

表2 药物作用后SGC-7901细胞周期的变化(n=6，±s)

表2 药物作用后SGC-7901细胞周期的变化(n=6，±s)

与对照组比较:1)P＜0.05;下表同

组别Ppd浓度(μg/ml)G2～M S G1～G0对照组0 20.35±1.9 41.20±2.8 39.02±2.2 1 0.5 7.67±0.31)14.69±3.31)77.11±3.01)2 1 4.23±1.21)23.98±4.11)74.76±4.01)3 2 2.89±0.31)17.34±2.21)76.08±5.281)4 5 6.08±0.91)17.51±1.01)80.08±6.21)5 10 4.43±0.81)18.91±2.41)81.17±4.91)

2.4 Ppd对SGC-7901细胞凋亡峰的影响 SGC-7901细胞经不同剂量的Ppd作用后，均有亚G1峰(即凋亡峰)出现，说明有部分细胞出现凋亡。对照组、0.5、1、2、5、10 μg/ml Ppd 组凋亡率分别为(0.19±0.0)、(0.27±0.1)、(6.26±1.2)、(27.58±4.8)、(27.48±4.7)、(28.31±4.9)%。相关分析显示，Ppd剂量与凋亡发生呈正相关(P＜0.05)。

2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 SGC-7901细胞在2.0、5.0μg/ml Ppd作用下，所提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳时出现典型的“阶梯”带，大小相当于180 bp或180 bp的整数倍，提示DNA在核小体连接时断裂，细胞发生凋亡，而对照组无此结果。见图1。

图1 DNA琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，近年来研究表明许多抗癌药物均能诱导肿瘤细胞发生凋亡，可能是这些药物抑制肿瘤生长机制之一。细胞凋亡的诱导具有选择性，不会造成周围组织的损伤。一般抗癌药物都可能通过诱导各自敏感肿瘤细胞凋亡来达到治疗目的，但其毒副作用限制了临床应用。选择有效药物调控凋亡相关基因或其相应产物，提高肿瘤细胞对抗癌药物敏感性，诱导肿瘤细胞进入凋亡，减少对机体毒副作用，这是肿瘤治疗取得成功的关键。细胞凋亡时DNA分解与常规坏死时DNA分解的最大不同，在于坏死时DNA的分解是随机的，产生的DNA碎片的分子量大小不一，在电泳时形成涂片(smear);而凋亡细胞的DNA分解的特点是双链DNA的断裂点在核小体之间的联接区。因此形成的DNA片段长度总是核心核小体亚单位DNA长度(180～200 bp)的整数倍。这样的DNA片段在琼脂糖电泳上形成特征性的“阶梯形”〔1，2〕，常作为检验细胞凋亡的生化指标而被广泛应用。细胞膜完整的活细胞对阳离子染料PI等有拒染能力，凋亡早期虽然细胞尚完整，但细胞膜转运功能出现一过性损伤，对染料的摄取量增加，流式细胞仪检测可呈现亚二倍体核型峰(凋亡峰)的特征，据此可区别凋亡细胞与坏死细胞。

SGC-7901细胞是伴有淋巴结转移的人胃癌细胞，已经失去了正常的细胞凋亡功能。发现能够诱导SGC-7901细胞凋亡的药物，对于晚期胃癌的治疗具有重要的意义。本实验Ppd作用于SGC-7901细胞48 h后，DNA凝胶电泳上即出现明显的DNA梯形带，并且随着剂量增高，条带数清晰，说明Ppd诱导SGC-7901细胞凋亡，并与其抑制SGC-7901细胞增殖有相关性。Ppd对SGC-7901细胞周期的影响非常显著，药物作用后，肿瘤细胞产生明显的G1期阻滞现象，Ppd为2.0μg/m l时，G1细胞百分率达76.08%，而在Ppd为10.0μg/m l时为81.17%，较对照组(39.02%)明显增多，而S、G2～M期细胞数明显减少。流式细胞术结果也证明，不同浓度的Ppd作用SGC-7901细胞后，在G1期的前面出现一个小的亚二倍体峰，即为凋亡峰，说明有部分细胞出现凋亡，在Ppd为2.0μg/ml时，其凋亡峰为27.58;Ppd为10.0μg/ml时，出现最大凋亡峰为28.31。说明随着Ppd剂量增加，处于凋亡峰的细胞比例呈增加趋势。Ppd诱导凋亡的机制，考虑有以下几个方面:①药物对肿瘤细胞的毒性作用，促进了细胞凋亡;②体外实验证实，Ppd使SGC-7901细胞产生明显的G1期阻滞现象，可能给抑癌基因提供了作用的靶点，如P53蛋白即是通过将细胞周期阻滞于G1期，对损伤DNA进行修复，当修复失败时诱导细胞凋亡;③其次Ppd抑制了肿瘤间质的血管生成，从而抑制了肿瘤组织的生长，此时肿瘤细胞凋亡的速度大于增殖的速度。

1 李罗丝，罗志勇，文 斌，等.人参皂苷Rh2对白血病HL-260细胞凋亡的诱导作用〔J〕.中国现代医学杂志，2006;16(21):3215-7.

2 陈明侠，徐华丽，于小风，等.20(S)-原人参二醇的抗肿瘤作用及免疫调节作用研究〔J〕.中国药师，2007;10(12):1165-8.

R28

A

1005-9202(2011)12-2250-02

吉林省科技厅资助项目(No.200705158)

秦俊杰(1965-)，男，医学硕士，副教授，主要从事消化系统疾病的诊断和治疗研究。

冷吉燕(1965-)，女，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事老年疾病的研究。

〔2011-02-12收稿 2011-04-21修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)