十六种鸟类二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

林树柱，杨 帆，刘先菊，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

鸟纲是动物种类最多的一个纲，世界上现存的鸟类有近9000种。鸟类与人类的关系也极为密切，有些鸟类作为宠物被人类豢养在家中，有些作为经济鸟类被大规模饲养，还有些鸟类是珍惜保护动物。鸟类的疫病常常会引起鸟的大量死亡，而且有些疫病甚至会传染给人类，因此对鸟类疫病进行监测，对保障国民经济发展与人类健康具有重要意义。血清学检测是动物病原检疫的重要手段，而标记的动物二级抗体是建立血清学检测技术的重要工具。但是世界范围内都缺乏标记的抗鸟类的二级抗体，为此本研究分离纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种禽类的IgY，免疫大耳白兔制备了兔抗这些鸟类的二级抗体，并用辣根过氧化物酶（HRP）对制备的二级抗体进行了标记，为鸟类血清学检测体系的建立提供了工具。

1 材料和方法

1.1 16种鸟类IgY的分离纯化

孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭去脂的卵黄液，采用亲和层析和饱和硫酸铵沉淀的方法进一步纯化IgY，去脂卵黄液稀释后过 Hitrap IgY Purification HP亲和柱，亲和产物再利用饱和硫酸铵进一步沉淀。具体纯化方法参照文献［1］进行。

赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭IgY通过切胶的方法进行纯化［3］。去脂卵黄液经饱和硫酸铵沉淀，得到 IgY的粗提液，再将粗提液在12％的SDS-PAGE上分离，电泳完毕后，小心将胶取下，从中间和两侧分别纵向切下三个条带，宽度约0.5 mm。取下凝胶，切下的胶条常规考马斯亮蓝R-250染色法染色15 m in。再置脱色液中脱色至条带清晰可见。将胶条复位，对照染过色的胶条的目的条带，用刀片切下未染色部分的凝胶相应位置的目的条带，加生理盐水将胶条研碎，备免疫用。

1.2 兔抗16种鸟类抗血清的制备及二级抗体IgG的纯化

利用纯化的16种鸟类IgY免疫大耳白兔，制备兔抗这16种鸟类一级抗体的抗血清，具体方法参照文献进行［4］。抗血清效价用琼脂糖凝胶免疫双扩散方法进行测定［5］。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS （20 mmol/L，pH 7.0）稀释，0.45μm膜过滤，利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 m L的预装柱进行亲和层析［6］，纯度都经SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳进行检测。

1.3 兔抗16种鸟类二级抗体的 HRP标记和标记抗体ELISA工作浓度测定

兔抗16种鸟类二级抗体的HRP标记采用过碘酸钠法，具体操作参照文献进行［3，7］。

用直接ELISA法测定标记抗体的工作浓度，利用非切胶纯化的 11种鸟类的 IgY 10μg/m L，0.1 m L/孔包被 ELISA板，4℃过夜。次日洗涤、封闭，相应的酶标记抗体用1％BSA-PBS液梯度稀释，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1 m L，37℃孵育1 h后洗涤3次，3 min/次。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃反应15 min。以2 mol/L H2SO4终止反应。用ELISA比色仪双波长450 nm/630 nm读取各孔A值。取A值为1.0左右的酶标抗体稀释度作为标记抗体的ELISA工作浓度［3］。

1.4 W estern blotting方法检测标记抗体

16种去脂的卵黄液利用12％的SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，湿法转移至NC膜上，封闭后分别与相应的适当稀释的标记二级抗体进行孵育，室温1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 m in，与底物反应后曝光。

2 结果

2.1 纯化16种鸟类卵黄抗体IgY

利用水稀释法、改良的饱和硫酸铵分级沉淀法、亲和层析或SDS-PAGE凝胶切胶纯化的方法纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种禽类的 IgY，11种非切胶纯化的禽类 IgY经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现其纯度达到了免疫的要求（图1） 2.2 Protein A纯化兔抗16种鸟类的二级抗体

图1 纯化的鸟类IgY的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified bird IgY

通过Protein A亲和层析纯化兔抗16种鸟类抗血清中的IgG，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现在还原条件下呈现清晰的重链和轻链两条带，几乎没有其他杂带。电泳图未给出。

2.3 ELISA方法鉴定HRP标记抗体的效价

采用过碘酸钠法对兔抗16种鸟类IgY的二级抗体进行了HRP标记，并用ELISA方法对其中11种标记二级抗体的效价进行了分析。以10μg/m L鸟类的IgY包被ELISA板，0.1 m L/孔，相应的酶标记抗体用1％BSA-PBST进行系列稀释，每个稀释度二孔，37℃孵育1 h后洗涤3次。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃15 m in。以2 mol/L H2SO4终止反应。在ELISA比色仪上采用450 nm/630 nm双波长读取各孔A值。取A值为1.0左右的酶标抗体稀释度作为标记抗体的ELISA工作浓度。结果如表1所示。

2.4 W estern b lotting方法检测标记抗体

16种去脂的卵黄液利用12％的SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，湿法转移至NC膜上，封闭后分别与相应适当稀释的标记二级抗体进行孵育，室温1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 min，与底物反应后曝光，结果显示标记抗体具有很好的特异性。标记二级抗体的稀释倍数分别为：HRP标记的兔抗虎皮鹦鹉IgY的二级抗体1∶200；HRP标记的兔抗灰雁、小鹈、鸽子、鹌鹑、草鹭、夜鹭、燕鸥IgY的二级抗体1∶500；HRP标记的兔抗赤嘴潜鸭、翘鼻麻鸭、长脚鹬IgY的二级抗体1∶1000；HRP标记的兔抗鹅、贵妃鸡 IgY的二级抗体1∶2000；HRP标记的兔抗鸬鹚、鸵鸟 IgY的二级抗1∶3000；HRP标记的兔抗孔雀IgY的二级抗体1∶30000。Western blotting结果如图2。

表1 ELISA方法检测HRP标记的抗体效价Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

图2 Western blot检测酶标抗体的特异性Fig.2 Determination of the specificity of rabbit IgG-HRP against the birds IgY with Western blot

3 讨论

卵黄抗体IgY是鸟类的主要抗体，其在卵成熟过程中从血清传递到卵黄中，IgY在卵黄中的含量超过其在血清中的含量［4］。本文建立了多种鸟类IgY纯化的方法，通过水稀释去脂、改良饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、切胶回收等方法，纯化了灰雁、鸬鹚、鸵鸟、小鹈、鸽子、鹅、孔雀、鹌鹑、贵妃鸡、草鹭、夜鹭、赤嘴潜鸭、燕鸥、长脚鹬、虎皮鹦鹉、翘鼻麻鸭等16种鸟类的 IgY。免疫大耳白兔制备了兔抗这些鸟类的二级抗体，并用辣根过氧化物酶（HRP）对制备的二级抗体进行了标记，结合之前制备的HRP标记的兔抗麻雀二级抗体，本项研究共建立了18种鸟类的血清学检测系统。这18种鸟类中有鹦鹉等在家庭中广泛豢养的鸟类，也有鹅、鸽子等大规模饲养的经济鸟类，还有孔雀等观赏鸟类，既有灰雁等长距离迁徙的鸟类，也有麻雀等生活在人类周围的留鸟，这个标记鸟类抗体库的建立部分的解决了动物病原和新发传染病病原学清学检测系统不完备的问题，为鸟类疫病的监测和控制提供了有效的工具。

鸟类是与人类关系极为密切，其作为宠物生活在人类家庭中，与人类日常生活关系密切，作为经济动物又是人类经济生活的重要组成部分，鸟类还是人类食物的重要来源。鸟类疫病常常会引起鸟类的大量死亡，同时也会给人类的健康带来威胁。鸟类传播的人兽共患病多数为无临床症状或自限性的，但偶尔也会出现严重疾病。而且鸟类的活动范围较大，尤其是迁徙鸟类，这种远距离的迁徙，增加了病原微生物扩散的风险，易导致爆发大范围的感染性疾病。例如高致病性禽流感至今已蔓延了全球多个国家，数以百万的禽类死亡，同时也引起感染病人的死亡。与鸟类相关病原体，引起人类呼吸系统或肺部疾病的有：鹦鹉热，禽流感、组织胞浆菌病、新城疫等；引起胃肠系统症状的有：沙门氏菌感染、弯曲杆菌病、贾第鞭毛虫病等；引起皮肤症状的有：丹毒丝菌病及一些由鸟类传播的皮肤病等［8-11］。因此建立有效的鸟类病原检测技术，控制鸟类疫病的发生，对保障人类的健康和社会的发展具有重要的意义。

［1］杨帆，刘先菊，林树柱，等.三种鸡形目雉科禽类卵黄抗体的纯化及二抗的制备［J］.中国比较医学杂志，2007，17（11）： 652-655.

［2］杨帆，林树柱，刘先菊，等.鹭科和鸬鹚科卵黄抗体的纯化［J］.中国比较医学杂志，2007，17（11）：659-661.

［3］杨帆，刘先菊，林树柱，等.兔抗麻雀 IgY酶标抗体的制备［J］.中国比较医学杂志，2008，18（5）：41-44.

［4］杨帆，刘先菊，林树柱，等.改良的硫酸铵沉淀法纯化大雁的卵黄抗体［J］.中国比较医学杂志，2007，17（11）：625-628.

［5］林树柱，李万波，刘先菊，等.乌鳢血清免疫球蛋白IgM的分离纯化及其兔抗血清的制备［J］.中国比较医学杂志，2007， 17（11）：648-651.

［6］林树柱，李万波，刘先菊，等.兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记［J］.中国比较医学杂志，2008，18（5）：45-49.

［7］金伯泉，李恩善.医学基础免疫学实验指导（第1版）［M］.北京：世界图书出版社，1990.

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