猴腺病毒研究进展

张荣建，贺争鸣（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

1 猴腺病毒的发现及分类

猴腺病毒（simian adenovirus，SAdV）是1956年 Hull等［1］人在美国用东南亚猴的肾细胞制造和检定小儿麻痹症疫苗时，首次分离获得的。随后Hoffert［5］等人也在猴子中检测到这些病毒。SAdV中许多是在脊灰疫苗生产和检定过程中从猴细胞培养物中分离得到的［6］。目前，根据血清学分类至少有25种猴腺病毒（SAdV-1～25），SAdV-1～20血清型来自猕猴、食蟹猴、绿猴、狒狒等旧大陆猴，SAdV-21～25源自黑猩猩、大猩猩等新大陆猴。根据血凝性将灵长类腺病毒分为人的HAdV-A～G七个亚群和猴的一个亚群 SAdV-A，其中 HAdV-E （HAdV-4、SAdV-22～25）、HAdV-G（HAdV-52、SAdV-1、SAdV-7）亚群中多数为猴腺病毒，还有一些分支的SAdV簇尚未被分类［7］。

早期对SAdV的基因组学研究很少，直到近年来替代载体系统的发展，人们才对非人灵长类腺病毒的研究兴趣日趋浓厚。SAdV-21～25、SAdV-1、SAdV-3等毒株相继被测序，并解析了其基因组结构。SAdV-1（34450 bp）与SAdV-3（34425 bp）大小相似，比HAdV-40（34214 bp）、HAdV-12（34125 bp）大，这四种病毒在灵长类腺病毒的巨大基因组中以基因组最小为特征［6］。系统发生分析表明，感染黑猩猩、大猩猩的SAdV和HAdV-BE亚群高度同源而与感染恒河猴等旧大陆猴的 SAdV（它们看起来与HAdVAF亚群关系较近）进化发生距离较远［8、20］。有报道认为感染恒河猴的 SAdV为灵长类腺病毒进化早期的分支，可能与 HAdV有共同祖先［8］。利用Megalign软件比对5种旧大陆猴SAdV六邻体一段序列，建立进化树（如图1）。

由图1知，可查到序列的5株旧大陆猴 SAdV中有两个较大的分支，一簇为 SAdV-1、7、20，代表HAdV-GF亚群，另一簇为SAdV-3、6代表SAdV-A亚群。目前感染恒河猴、食蟹猴的主要为HAdV-G、SAdV-A亚群［7］。

2 猴腺病毒的生物学特性

（1）形态结构

图1 五株旧大陆猴SadV的进化发生树（Megalign软件比对六邻体基因一段序列（346nt）建立进化树，序列来自GenBank中）Fig.1 Phylogenetic tree of five old wold monkeys adenovirus strains.（The tree was reconstructed from an alignment of the part sequence of hexon gene（346nt）by Megalign，all sequence form GenBank）

电镜下，SAdV呈二十面体球形，无囊膜，直径70～80 nm。衣壳外有宽2 nm，长约10～31 nm的纤维突起，内含线状双链DNA和核心蛋白形成的髓芯。衣壳由252个壳粒组成，这些壳粒呈棱柱状排列在三角形的面上，每边六个，其中240个为六邻体，12个为五邻体基底。每个五邻体基底上结合着一根纤维突起，纤维顶端的球形区在感染细胞时与细胞受体结合。病毒粒子在感染细胞核内常呈晶格状排列［9、10］。

（2）基因组结构及转录

SAdV的基因组大小差异较大，其中恒河猴腺病毒较小约34kb，而黑猩猩腺病毒较大约36 kb，与人的相近。SAdV具有哺乳动物腺病毒属的一般基因组特征（结构如图2）［6］，两端为40～200 bp的末端反向重复序列（ITR），内部分为5个早期转录单位（E1A、E1B、E2、E3、和E4）、两个即早期转录单位（pⅨ和Iva2）以及一个晚期转录单位（L1～L5）。此外，病毒基因组中还存在一个或两个VA-RNA基因［9，11］。VA-RNA基因数量、E3和 E4区在不同腺病毒亚群间变化较大［8］。多数恒河猴腺病毒有一个VA-RNA基因，而猩猩腺病毒有两个［11］。

图2 SAdV-1基因组结构（每一刻度为5 kb，阴影示E1A、E1B、E3和E4区，选自Ga＇bor M.Kova＇cs，etal./Journal of General Virology）Fig.2 Genetic content of SAdV-1.（The genome is depicted as a central horizontal line marked at 5 kbp intervals，with the E1A，E1B，E3 and E4 regions shaded，form Ga＇bor M.Kova＇cs，etal./Journal of General Virology）

ITR序列长度不一，因不同株型而异，是病毒DNA复制起始子和一些顺式激活序列所在区域。基因组左端载有包装信号，ITR和包装信号是腺病毒基因组复制和病毒包装必不可少的顺式作用元件。5＇端有共价结合的末端蛋白（TP），可作为引物启始病毒基因组的复制，且与病毒的感染有关，含TP的 DNA感染性可提高100倍［10］。发生在病毒复制前的转录称为早期转录，表达大量早期蛋白来调整细胞状态为病毒复制提供有利微环境（主要涉及E1A、E1B产物功能），抑制宿主细胞抗病毒的防御体系（以E3和VA-RNA为主）［9］，并激活晚期启动子表达结构蛋白，为病毒组装和成熟做准备。复制后，晚期基因由主要晚期启动子（MLP）起始，转录出长达20 kb的原初转录物，后根据腺苷酰化位点的差异，经过剪切加工最终形成18种不同的mRNA。根据剪切方式和终止位点的不同，可分为5组：L1（52K、p IIIa）；L2（III、pⅦ、V）；L3（pVI、hexon、protease）；L4（100K、33K、pVIII）；L5（Fiber1、Fiber2）［9、10、12］，如图 2。SAdV-1有两个 Fiber基因与HAdV4041相似，而SAdV-3只有1个。

晚期基因编码病毒包装所需结构蛋白，基因结构较稳定。其中hexon基因部分序列进化上高度保守，常被用于系统进化发生分析，也是PCR检测引物设计的常用序列。此外，pol、DBP、ptp基因进化上也比较保守。

（3）衣壳蛋白结构与抗原性

衣壳蛋白主要包括六邻体（hexon）、五邻体（penton）、纤维蛋白（fiber）等。六邻体蛋白是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白，为同源三聚体，单体的中部和C端较保守，有7个高变区（HVR），HVR2～5和HVR6位于蛋白分子表面。六邻体蛋白能够刺激机体产生中和抗体以及群和型特异性抗体［9］。对六邻体而言，型特异性表位位于表面，而内部保守的抗原，对衣壳结构形成至关重要，因此有很广泛的群特异性。群特异性六邻体抗体已作为一般腺病毒诊断试剂被广泛应用［13］。六邻体蛋白的Loop1、Loop2是较好的中和抗原决定簇，因此对这段基因的克隆、表达、纯化，有利于其免疫学研究。但也有研究表明，存在于血清中的抗体仅与三聚体六邻体反应，而不结合六邻体多肽链［14］。

纤维蛋白也为同源三聚体，它的结构可分为尾、杆及球形区3部分，N端尾部与五邻体基底相连，较保守；杆端一般由多个含15个氨基酸残基的重复亚单位构成［10］；球形区为功能区，可与宿主细胞受体结合，血凝素也位于球形区。纤维蛋白远端具有型特异性而尾部有亚群特异性。五邻体基底，是多肽Ⅲ的五聚物，与三聚体纤维蛋白结合形成五邻体复合物，封闭衣壳上的12个顶点，具有群特异性［1，10，15］。首先，纤维蛋白的球形区与细胞受体结合使病毒粘附到细胞上，再通过五邻体基底与细胞表面整合蛋白的相互作用，触发细胞膜通透性使病毒内化进入宿主细胞［13，15］。

3 猴腺病毒的感染特点

SAdV具有明显组织嗜性和细胞依赖性，易产生细胞病变（CPE），感染猴多为隐性感染，可时常从粪便中检出感染性的SAdV［2］。少数毒株引起呼吸道疾病，腹泻、肺炎、结膜炎等。宿主以体液免疫应答为主，产生 anti-Hexon、anti-Fiber和 anti-penton3种中和抗体［13］。一些 SAdV毒株接种新生仓鼠可引起肿瘤［7］。

组织培养研究表明，SAdV对宿主动物源性的细胞最为敏感，可在猴肾原代或传代细胞中增殖，一般不感染异种动物细胞。但猩猩腺病毒与人腺病毒关系亲密，可能源自同一祖先，也可感染人的细胞系。病变特征为细胞变圆，并形成葡萄串状团聚块，核内出现许多小的嗜酸性包涵体，出现于上毒后3～4 d［1］。有文献报道，SAdV在猩猩和恒河猴健康种群中普遍流行，粪便中检出率高，相比之下人粪便中则很少见［2］。猴免疫应答以体液免疫为主，产生的中和抗体亲和力高于人的，而细胞免疫则没有人的精细高效，SAdV可能通过E3的调控机制逃避免疫。SAdV可能感染猴小肠上皮细胞，造成SAdV慢性感染并由肠道持续向外排毒，而人腺病毒则被抑制在很低的水平。另外，在感染 SIV的长尾猴中SAdV的检出率明显提高，SIV-SAdV协同感染在SIV阳性猴中很普遍，相似的报道也出现在人中，免疫不完全的人群 HAdV的检出率更高［3］。

SAdV在猩猩种群中的高度流行及与HAdV十分相近的亲缘关系，表明存在由猩猩传染给人的潜在风险。但经过对50位动物工作者血清的检测未发现SAdV中和抗体。尽管恒河猴SAdV的感染率更高，但与人的进化距离远，不太可能传染给人［2］。尽管如此，已从肠胃炎病人中分离出来一株类似恒河猴 SAdV-1的毒株［2］，全基因组一致性高达97％，但其抗体不能中和SAdV-1。

目前感染恒河猴、食蟹猴的主要为 HAdV-G、SAdV-A亚群，据文献报道腹泻猴粪便样本中，腺病毒抗原阳性约占21％，PCR阳性占46％［7、18］，也有调查显示新鲜粪便中，SAdV PCR阳性率高达67％［2］。血清学检测我国云南某地区野生成年恒河猴群中，抗体阳性率甚至高达80.8％［16］。非人灵长类中腺病毒的高感染率表明可利用非人灵长类作为腺病毒感染动力学研究的模型，并用于检测腺病毒疫苗临床前的有效性和安全性［3］。此外在猴源性生物制品的检定中SAdV污染应引起我们的注意。

4 猴腺病毒的检测

加强实验用猴和猴源性生物制品的病毒检测不仅可以保证疫苗等生物制品的安全性，提高实验用猴质量，同时也减少了人类感染动物源性病毒的潜在风险。传统SAdV的检测方法是收集标本进行病原分离培养，应用凝集抑制、免疫荧光、放射免疫、限制性内切酶分析等方法［4、6］，不仅费时费力，其结果准确性也不高。目前还没有检测 SAdV的ELISA商业化试剂盒，为了研究非人灵长类中腺病毒的感染流行情况，检测人肠道腺病毒（HAdV-40 41）的ELISA试剂盒被应用于研究，并首次在橄榄色狒狒、长尾猴中检测到腺病毒，感染率分别为52.9％、48.9％［3］。ELISA简便、快捷，提高了检测的准确性。但SAdV与HAdV的抗原结构和免疫应答不尽相同且血清型多，因此可能漏检。目前，国内外建立了一系列高敏感度的对人腺病毒（HAdV）的检测方法和分型方法，如 Nested-PCR、荧光定量PCR、多重 PCR等［17］，这对检测动物 SAdV感染情况以及分析猴源性生物制品（如减毒活疫苗）的SAdV污染情况具有一定的借鉴意义。

在最近的一些研究中，为了更精确的检测SAdV的流行情况运用了 PCR技术。K.Ba＇nyai［7］等人特异性针对hexon保守序列设计引物，扩增产物大小约300 bp并通过测序和系统进化分析所扩增片段描述了一些SAdV的分子生物学特征。结果表明在中国一个大的灵长类栖息地发现了不寻常的高流行率和SAdV的基因多样性，并分离了一些新的SAdV毒株，是否代表新的 SAdV亚群需进一步确定。而 Soum itra Roy［2］等人特异性针对 pol保守序列设计了嵌套引物，用于特异性的诊断由肠道脱落的SAdV，提高了敏感度，检出率高达67％，比一般PCR检出率高。国外文献报道中，还应用了透射电子显微术，免疫荧光检测、核酸杂交等方法［18、19］，在分析动物 SAdV感染状况和检测生物制品SAdV污染时，适当的联合运用各种检测方法对SAdV的综合评估非常重要。随着快速敏感、简便准确的SAdV检测方法的建立，将会发现更多新的SAdV毒株。

5 总结

近年来随着猴腺病毒替代载体系统的发展，SAdV在实验用猴中的感染流行情况开始受到关注。最新调查发现，SAdV在非人灵长类中高度流行，可能存在由人到猩猩传播感染［2、4］。猕猴群中感染率更高，且曾在生产用猴肾细胞和脊灰减毒疫苗检定中分离出一些 SAdV毒株［1、6］。不断探索敏感性更高、特异性更好的SAdV检测方法，对于监控SAdV传播和保证猴源性生物制品安全具有深远意义。

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