瘦素和转化生长因子β1在大鼠肝纤维化过程中的作用

宋维芳，徐军全，马丽英，连小娟，王明亮，郭明清

（1.山西医科大学汾阳学院病理生理学教研室，汾阳 032200；2.山西省汾阳医院感染科肝病区，汾阳 032200）

肝纤维化是一种损伤愈合反应，是慢性肝病发 展成为肝硬化的必经过程，是多种因素参与的、复杂的、并且在一定程度上可逆的病理过程。瘦素是由ob基因编码的蛋白类激素，对机体能量代谢的调节具有重要的作用。近年来的研究发现瘦素与肥胖、氧化应激和脂质代谢异常有关［1］。最新的研究显示活化的星状细胞瘦素mRNA表达和蛋白质合成均增加［2］，提示瘦素可能与肝纤维化有关，而转化生长因子β1（transform ing grow thβ1，TGF-β1）是目前已知的最强的促纤维化因子之一，其在肝纤维化过程中主要的作用是促进细胞外基质的合成并抑制其降解，也有间接促星状细胞增殖活化作用［3］。为了进一步明确肝组织瘦素和 TGF-β1在肝纤维化发生、发展过程中的作用，我们设计了本研究。

1 材料和方法

1.1 动物及材料

健康清洁级雌性 W istar大鼠，体重（220±20） g，购自山西医科大学实验动物中心［SCXK（晋） 2010-0001］。四氯化碳为中国中邦化工分析纯；瘦素放射免疫测定试剂盒购于美国 Linco公司；TGF-β1ELISA试剂盒购于晶美生物工程有限公司；天狼猩红和羟脯氨酸标准品购于美国Sigma公司。

1.2 动物的分组及处理措施

44只雌性W istar大鼠，常规在控光鼠房中分笼普食普水饲养，温度18℃ ～25℃，湿度45％，1周后，确定所用实验大鼠健康后，开始实验。将44只大鼠随机分为5组，正常对照组、模型组1周、模型组2周、模型组4周、模型组6周。正常对照组给予皮下注射生理盐水，每周2次（周一和周五注射），其余各组给予首剂5 m L/kg体重CCl4分析纯，之后按3 m L/kg体重皮下注射40％CCl4植物油（V/V）混合液，时间和次数与正常对照组同步，各组动物按实验设计分别于给药后1周、2周、4周和6周末模型形成后（正常对照组每次至少相应处理3只大鼠），在乙醚麻醉，无菌无热源条件下，从大鼠腹主动脉采血，注入加有肝素（15 U/m L）的无热源玻璃试管中，4℃离心20 m in（3000 r/m in），吸出血浆置于玻璃试管中封口，于-80℃低温保存。取肝左叶一部分立即固定于4％多聚甲醛，24 h内石蜡包埋，5 μm切片；一部分于-80℃低温保存。

1.3 检测项目与方法

1.3.1 肝纤维化程度的判定 常规HE染色和天狼猩红胶原染色、显微镜观察并摄像和李文才等［4］报道的方法测定肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量以判定肝纤维化的程度。胶原纤维呈红色，运用 Image-pro plus5.0图象分析软件半定量计数肝组织胶原面积，每组织随机取5个视野，通过比较各组肝组织的纤维化指数（FI）值评价肝纤维化程度［5］。FI=纤维染色区面积/整个视野面积×100％。

1.3.2 赖氏法测定血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）。1.3.3 放射免疫法测定肝组织和血浆瘦素水平。

1.3.4 双抗夹心酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定肝织组织和血浆TGF-β1含量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况及造模效果

实验过程，正常对照组大鼠健康状态良好，体重增加（100±30）g，肝脏表面光滑，色质红润；模型组大鼠实验前期出现烦燥、易激惹，约1周后趋于平静，随着给CCl4时间延长活动慢慢减少，精神萎靡，毛发杂乱无光，食量减少，体重明显下降，肝脏表面欠光滑，色质灰暗，体积变大，边缘圆钝。模型组病理切片观察有较多纤维形成（彩插3图1B、D）；从2周起模型组肝组织Hyp含量开始显著升高，后呈递增趋势，6周时达最高（表1），提示肝纤维化模型形成。

表1 各组大鼠血浆ALT、肝组织Hyp和FI的变化Tab.1 Changes of plasma ALT，liver Hyp，FI in each group

表2 血浆和肝组织瘦素、TGF-β1的变化Tab.2 Changes of leptin and TGF-β1 in plasma and liver homogenate

2.2 肝组织病理学变化

HE和胶原染色显示：光镜下正常对照组大鼠肝细胞核多为单个，以中央静脉为中心呈放射状排列，小叶结构正常，肝细胞索排列规则有序，未见变性坏死，肝窦与汇管区有少量胶原纤维（彩插3图1A、C）；模型组从1周末就有肝细胞出现脂肪变性，2周可现肝细胞脂肪变性加重，有轻度的坏死及纤维结缔组织增生，4周末表现为坏死区及汇管区纤维结缔组织增生较明显并成细小条索，6周末可见汇管区有大量炎症细胞浸润，纤维增生明显加重，呈星芒状向肝小叶内延伸，有假小叶形成（彩插3图1B、D）。Image-prop lus 5.0图像分析结果：FI变化显示模型组6周时肝组织中胶原纤维含量比正常对照组明显增多（P＜0.05）（如表1）。

2.3 血浆ALT和肝组织Hyp含量变化

从第1周末起模型组ALT和Hyp含量比正常对照组有显著升高，模型组ALT第2周末达高峰，第4至6周又逐渐回降（与2周组比较（P＜0.05），但与正常对照组相比仍显著升高（P＜0.05）（表1）；Hyp则呈逐渐升高的趋势（表1）。

2.4 血浆和肝组织瘦素、TGF-β1的变化

模型组各时期血浆和肝组织瘦素均高于正常对照组，且随着 CCl4作用时间的延长呈梯度上升（表2），与正常对照组比较，模型组血浆和肝组织TGF-β1含量从4周开始显著升高，6周达最高（表2）。

2.5 相关性分析

肝纤维化过程中：肝组织瘦素含量与 TGF-β1含量呈显著正相关关系（r=0.887，P＜0.01）；肝组织瘦素含量与FI呈显著正相关关系（r=0.754，P＜0.01）；肝组织TGF-β1含量与FI呈显著正相关关系（r=0.899，P＜0.01）。

3 讨论

肝纤维化是大多数慢性肝病共有的病理过程，是继慢性损伤后肝组织修复过程中的代偿反应，是慢性肝病发展为肝硬化的必经病理过程，目前认为其发病机制是由于各种原因，使肝细胞外基质（ECM）的沉积和降解的动态平衡打破而造成肝脏基质成分改变和数量的增加，其在一定程度上是一个可逆的过程。研究发现各种慢性损害因素引起肝损伤的病理过程中，损害因素可直接或间接介导免疫病理损伤，从而导致肝星状细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞以及纤维化附近的炎症细胞等分泌大量的TGF-β1，同时TGF-β1又可活化星状细胞，进一步促进ECM成分的合成，同时抑制ECM的分解，导致ECM的大量沉积，从而引发肝纤维化的形成［6-7］。也有报道 TGF-β1在肝纤维化过程中可活化肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC），还可促进胶原基因的表达，从而促进细胞外基质的合成与沉积，是肝纤维化过程中最重的始动因子之一，TGF-β1作用涉及面广，具有双向作用，即其正常表达时可抑制炎症反应、抑制细胞增殖，异常表达时可诱导细胞增殖、纤维蛋白的形成，从而促进纤维化的发生和发展［8］。

瘦素是由ob基因编码的蛋白类激素，由167个氨其酸残基组成，分子量为16×103［9］，通常认为瘦素主要是由脂肪细胞表达，但近年来的研究发现胎盘、肝脏组织和胃组织内可产生瘦素，且瘦素的表达与肝纤维化有着密不可分的关系［10］，也有研究发现，肝硬化患者血清瘦素水平明显高于慢性肝炎组，但令研究者困惑的是，该两组患者瘦素水平却均低于正常对照组，并发现女性患者的血清瘦素水平明显高于男性，也有研究发现血清瘦素水平无论男女，均与身体脂肪百分比（BFP）及身体脂肪量（BFM）有显著相关性，由此可见影响血清瘦素水平的因素更多是非肝脏来源的，故肝纤维化瘦素血清学研究存在很大的障碍和局限性。最近有研究者发现肝组织在纤维化病程中有大量瘦素表达，由此提示肝组织原位瘦素与肝纤维关系可能更为直接，故我们通过动态观察肝纤维化过程中肝组织瘦素、TGF-β1和 Hyp含量变化的同时辅以血浆相应指标的对照研究，并对肝组织瘦素、TGF-β1和肝纤维化指数（FI）进行了相关性分析。

在我们的实验中，首先HE和胶原染色显示，模型组有较多纤维形成，证明造模成功；其次我们发现，在肝纤维化过程中血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）从模型组1周开始显著升高，第2周达最高，后又回降，提示化学因素CCl4在导致肝纤维化的同时，可损伤肝功能，且在首次受到打击时，可对肝功能形成强烈的应激性损害，后随着机体的调节，可逐渐适应慢性损害，从而显示出肝功能回降的趋势；实验结果显示在肝纤维化过程中肝组织Hyp含呈递增趋势，表明在肝损害过程中肝脏的纤维化修复一旦激活，将会持续进行，直至发生肝损伤的不可逆病变-肝硬化病理过程；最后我们在研究的过程中，为了排除其它因互对瘦素和 TGF-β1的影响，直接对模型组各时期肝组织瘦素表达和 TGF-β1水平以及 FI进行了相关性分析，发现瘦素表达和TGF-β1水平以及 FI两两成显著正相关，另不论血浆还是肝组织，瘦素均先于TGF-β1表达升高，由此我们初步推断，肝组织原位瘦素水平的是肝纤维化发生发展过程的一个重要始动环节，并且肝组织原位瘦素水平的升高可能是通过上调 TGF-β1表达，从而促进肝纤维化的发生和发展。

然而，瘦素在肝纤维化发生、发展过程中的作用有多大，是肝纤维化发生、发展的关键因素，还是一种辅助因素，目前仍然不清，我们今后的实验将进一步研究；还有肝组织原位瘦素在人类慢性肝损伤过程中的作用机制如何，也是我们今后研究的目标。

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［10］卢建华，刘勇钢，郎振为，等.慢性乙型肝炎患者肝组织瘦素的表达［J］.中华传染病杂志，2007，25：177-178.