十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

林树柱，刘先菊，杨 帆，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

近年来感染性疾病有了提高的趋势，而且传播速度快、范围广。在人类的感染性疾病中有近2/3为人兽共患性疾病，而且这一比例是随着时间提高的，在过去的十几年中，动物源性的感染性疾病已经席卷了全球［1，2］。哺乳类动物与人类关系密切，是很多人兽共患病病原的宿主、传播媒介和传染源。发展先进的动物病原检测方法，不仅可以有效地保护动物，而且可以防控新发传染病。血清学检测是动物病原检疫的重要手段，有着许多不可替代的优势，而标记的动物二级抗体是建立血清学检测技术的重要工具，目前全世界都存在着标记的动物二级抗体缺乏的问题。为此本研究分离纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的IgG，免疫大耳白兔制备了兔抗这些动物的二级抗体，并用辣根过氧化物酶（HRP）对制备的二级抗体进行了标记，为这些哺乳动物血清学检测系统的建立提供了重要的工具。

1 材料和方法

1.1 17种哺乳动物血清IgG的分离纯化

取恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂血，室温静置1 h，4℃过夜，4000 r/min离心20 min，得正常血清，分装，-80℃保存备用。

恒河猴、东北虎、原驼、果子狸、食蟹猴、马鹿、骆驼、熊猴和雪貂血清5 m L，用生理盐水等体积稀释后，再以50％饱和硫酸铵和33％饱和硫酸铵进行分级沉淀，获得初步纯化血清 IgG。初步纯化的样品再利用HiTrap Protein A HP 5 m L预装柱（GE公司）进行亲和纯化［3，4］。

布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、梅花鹿、长爪沙鼠、大仓鼠、豚鹿和大耳羊血清5 mL，用生理盐水等体积稀释后，再以50％饱和硫酸铵和33％饱和硫酸铵进行分级沉淀，获得初步纯化血清 IgG。初步纯化的样品再利用 HiTrap Protein G HP 5 m L预装柱（GE公司）进行亲和纯化［5，6］。

1.2 兔抗17种哺乳动物抗血清的制备及二级抗体IgG的纯化

利用亲和纯的17种哺乳动物IgG免疫大耳白兔，制备兔抗这17种哺乳动物一级抗体的抗血清，具体方法参照文献进行［5］。抗血清效价用琼脂糖凝胶免疫双扩散方法进行测定［7］。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS（20 mmol/L，pH7.0）稀释，0.45μm膜过滤，利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的预装柱进行亲和层析［8］，纯度都经SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳进行检测。

1.3 兔抗17种哺乳动物二级抗体的 HRP标记和标记抗体ELISA工作浓度测定

兔抗17种哺乳动物二级抗体的HRP标记采用过碘酸钠法，具体操作参照文献进行［8，9］。

用直接ELISA法测定标记抗体的工作浓度，先利用亲和纯化的17种哺乳动物的 IgG 10μg/m L，0.1 mL/孔包被 ELISA板，4℃过夜。次日洗涤、封闭，相应的酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶30000、1∶60000，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1 mL，37℃孵育1 h后洗涤3次，3 min/次。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃反应15 min。以2mol/L H2SO4终止反应。用ELISA比色仪双波长450 nm/630 nm读取各孔A值。取A值为1.0左右的酶标抗体稀释度作为标记抗体的ELISA工作浓度［10］。

1.4 Westernblot方法检测标记抗体

纯化的17种哺乳动物IgG利用12％的SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，湿法转移至NC膜上，封闭后分别与相应的适当稀释的标记二级抗体进行孵育，室温1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 min，与底物反应后曝光［10］。

2 结果

2.1 纯化17种哺乳动物血清IgG

利用饱和硫酸铵盐析方法，结合 Protein A或Protein G亲和层析法纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的IgG，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现其纯度达到了免疫的要求（图1）。

图1 亲和层析纯化哺乳动物IgG的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified mammal IgG with Affinity chromatography

2.2 ProteinA纯化兔抗17种哺乳动物二级抗体

用纯化的恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的IgG分别免疫大耳白兔4次后，利用琼脂糖凝胶免疫双扩散的方法检测抗血清效价达到1∶32以上，取血，制备抗血清，每只兔子得抗血清50 mL左右。

通过Protein A亲和层析纯化兔抗17种哺乳动物抗血清中的IgG，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现在还原条件下呈现清晰的重链和轻链两条带，几乎没有其他杂带。电泳图未给出。

2.3 ELISA方法鉴定HRP标记抗体的效价

采用过碘酸钠法对兔抗17种哺乳动物 IgG进行了HRP标记，并用ELISA方法对标记产物的效价进行了分析。以 10μg/m L的哺乳动物 IgG包被ELISA板，0.1 m L/孔，相应的酶标记抗体用 1％ BSA-PBST进行系列稀释，每个稀释度二孔，37℃孵育1h后洗涤3次。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液 0.1 m L，37℃15 m in。以 2 mol/L H2SO4终止反应。在ELISA比色仪上采用450 nm/ 630 nm双波长读取各孔 A值。取A值为1.0左右的酶标抗体稀释度作为标记抗体的ELISA工作浓度。结果如表1所示。

2.4 Westernblotting方法检测标记抗体

纯化的17种哺乳动物IgG利用12％的SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，湿法转移至NC膜上，封闭后分别与相应适当稀释的标记二级抗体进行孵育，室温 1 h，TBST洗膜 3次，10 m in/次，TBS洗膜10 min，与底物反应后曝光，结果显示标记抗体具有很好的特异性。标记二级抗体的稀释倍数分别为：兔抗雪貂 IgG-HRP 1∶20000；兔抗恒河猴、虎 IgGHRP 1∶8000，兔抗布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、果子狸、食蟹猴、长爪沙鼠、豚鹿、熊猴 IgG-HRP 1∶4000；兔抗梅花鹿、骆驼、大仓鼠、大耳羊 IgG-HRP 1∶2000；兔抗原驼、马鹿 IgG-HRP 1∶1000。Western blot结果见图2。

表1 ELISA方法检测HRP标记的抗体效价Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

图2 Western blot检测酶标抗体的特异性Fig.2 Determination of the specificity of HRP-IgG of rabbit anti-mammals with Western blot

3 讨论

哺乳动物是与人类关系最为密切的物种之一，其作为宠物生活在人类家庭中，与人类日常生活关系密切，作为经济动物又是人类经济生活的重要组成部分，是农村经济的支柱产业之一，哺乳动物还是人类食物的重要来源，有些哺乳动物也是科学工作中重要的实验动物。由于哺乳动物与人类关系密切，亲缘关系又比较近，所以哺乳动物成为了许多人兽共患病的传播媒介或传染源［11］，如狂犬病、弓形虫病等就是由宠物狗、猫等传染给人类的人兽共患性感染性疾病，流行性出血热、鼠疫等就是由啮齿类动物传播的严重的传染病，布鲁氏菌病等是由牛、羊等经济动物传播的人兽共患疾病。动物疫病的发生不仅威胁道人类的健康，也会给国民经济带来重大损失。因此建立有效的哺乳动物病原检测技术，控制哺乳动物疫病的发生，对保障人类的健康和社会的发展具有重要的意义。

血清学检测技术既可以检测正在感染的动物，又可以检测既往感染的动物，而且取材简单，在病原检测中具有不可替代的作用，因此建立这些动物的血清学检测体系对保障社会经济发展和人类健康具有重要的意义。标记的二级抗体的缺乏是制约血清学检测体系建立的重要因素，本研究制备了HRP标记的兔抗恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的二级抗体，结合之前制备的HRP标记的兔抗狗、家猫、豚鼠、金仓鼠、松鼠、花鼠和龙猫等7种宠物的二级抗体［12］，和HRP标记的兔抗家猪，绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂等9种重要经济动物的二级抗体［13］，及 HRP标记的兔抗蝙蝠IgG，共计制备了34种哺乳动物的标记二级抗体。这34种哺乳动物分别分布在6个目、10个科中，既包含宠物、经济动物，也包含恒河猴、食蟹猴、雪貂等重要的实验动物，还包括东北虎等珍稀动物。这个标记的二级抗体库的建立，部分的解决了中国乃至世界范围内的动物病原和新发传染病病原学清学检测系统不完备的问题，为控制动物疫病，保障国民经济发展，保护珍稀动物、保证人类健康和应对新发传染病做了技术储备和资源储备。

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