一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析

孔德强，李爱学，曾 林，赵彦斌，孙兆增，胡仲明

（北京军事医学科学院实验动物中心，北京 100071）

雌二醇对下丘脑-垂体-性腺轴具有双向的调节作用。在卵泡生成的早期，中等水平的雌二醇就会抑制促卵泡生成素的释放，发挥负反馈调节作用；但在发情前期，雌激素的突然上升会引起下丘脑/垂体促性腺激素释放激素的迅速增高，发挥正反馈作用，从而引起动物的发情。目前对雌二醇在下丘脑/垂体性腺轴发挥正负两种调节作用的机理还不清楚，对雌二醇作用的部位也不是很清楚。但越来越多的资料证实，雌二醇的正负反馈作用与受体在不同组织的表达差异、表达水平和表达时间密切相关［1-4］。

在大多数的哺乳动物，体内都存在α和β两种受体。哺乳动物的α和β两种受体在下丘脑-垂体-性腺轴都广泛存在，其中α受体是发现最早的一种受体。Kenney的实验表明，雌二醇的α受体在负反馈作用中起主要的作用［5］，但 Lindzey的实验表明，雌二醇的α受体在正负反馈作用中都起作用［6］。β受体的发现相对较晚，对其功能的研究相对较少。仅有的一些资料证实，ERβ可调节个体的生殖过程，包括生殖器官的发育和生殖细胞的成熟，健康卵巢滤泡中ERβ高表达而ERα无表达，胎鼠或成年鼠睾丸中均有多种细胞表达ERβ。Hatoya的实验证实，比格犬下丘脑、垂体和卵巢中 β受体的表达量在由间情期到发情期的转变过程中，表达量逐渐上升，但α受体的变化趋势并不明显，提示ERβ在比格犬的生殖细胞的成熟过程中同样发挥了重要的作用［7］。

我们前期的实验证实，在比格犬的间情期末，雌二醇的正反馈作用对比格犬的发情具有重要的作用［8］，并且Hatoya的实验证实在比格犬的间情期末，雌二醇β受体的表达量变化明显，推测雌二醇β受体可能在雌二醇的正反馈作用中发挥重要作用。但目前对比格犬雌二醇受体的信息了解较少，因此本研究拟初步研究雌二醇β受体的序列组成和结构，为深入研究其在雌二醇正反馈调节中作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

4只成年雌性比格犬，由本中心提供，实验动物合格 证 号 ［SCXK-（军）2002-001］。Trizol为Invitrogen公司产品；反转录试剂盒ReverTra Ace-α-为TOYOBO公司产品；DEPC（Promega）；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒（杭州BioFlux公司）；LA -Taq，dNTP，Oligo（dT），pMD18-T克隆载体，Eco RⅠ内切酶，Hin dⅢ为大连宝生物公司产品；E.coli DH5α感受态为北京博迈德公司产品。根据比格犬雌二醇受体β的基因序列设计两对引物，分两段扩增其全长基因：引物1：5＇-aagagtttcctcagctgttgcc-3＇，引物 2：5＇-gtcgaagatttccagaattcc-3＇，引物 3：5＇-ggaattctggaaatcttcgac-3＇，引物 4：5＇-aggcctgtttgcttcagactg-3＇。

1.2 方法

1.2.1 比格犬下丘脑、垂体、卵巢和子宫总RNA的提取：

将RNA提取所用的剪刀、镊子和玻璃棒等物品180℃干烤过夜；将玻璃用品用0.1％的DEPC水浸泡过夜，高压后60℃烘干。选取4只比格犬新鲜的下丘脑、垂体、卵巢和子宫组织20 mg，剪碎后放于5 m L的离心管中；将离心管置于液氮中充分冷却，用玻璃板快速研磨；研磨充分后加入1 mL的 Trizol。按照Trizol使用说明书，提取不同组织的总RNA。

1.2.2 比格犬雌二醇 β受体的基因全长序列的获得：

分别以提取的下丘脑、垂体、卵巢和子宫的总RNA为模版，以 olig（dT）为反转录引物，进行反转录反应。反应条件为：42℃，1 h；95℃，5m in；4℃，5 m in。将下丘脑、垂体、卵巢和子宫的反转录产物混合，以2μL混合的反转录产物为模版，利用 LATaq酶扩增比格犬雌二醇受体β的基因。利用引物1和2扩增比格犬雌二醇受体 β基因的前段序列（β上），利用引物3和4扩增比格犬雌二醇受体β基因的后段序列（β下）。反应条件都为：预变性95℃，4 min；30个循环，95℃ 30 s，52℃40 s，72℃ 2 min；最后72℃延伸7 min。利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果，并用凝胶回收试剂盒回收基因片段。

1.2.3 比格犬雌二醇 β受体基因的克隆测序和序列比较：

将回收后的基因片段连接到pMD18-T克隆载体，并转化到E.coli DH5α感受态细胞。利用PCR和Eco RⅠ和Hin dⅢ双酶切结合的方法筛选阳性重组子，将阳性克隆进行测序，每段基因选择两个阳性克隆，分别双向测序。利用DNAMAN软件编辑测序序列，并与比格犬的基因序列进行同源性分析。

2 结果

2.1 比格犬下丘脑、垂体、卵巢和子宫总 RNA的提取结果

成功的从四只比格犬的下丘脑、卵巢和子宫中提取的总RNA，但垂体的总RNA提取都没有成功，结果见图1。

2.2 比格犬雌二醇受体β上基因片段和β下基因片段

图1 总RNA的提取结果Fig.1 The results of total RNA extraction

以下丘脑、卵巢和子宫的混合反转录产物为模板，利用引物1和2，成功的扩增到比格犬雌二醇受体β上基因片段，其主要条带的长度约为1100 bp；利用引物3和4，成功的扩增到雌二醇受体β下基因片段，其主要条带的长度约为1000 bp，四只比格犬的扩增结果相同，结果见图2和图3。

2.3 比格犬雌二醇受体β上基因片段和β下基因片段的克隆

图2 雌二醇受体β基因前段序列的扩增结果注：1为100 bp ladder分子量标准，2，3，4和5为阳性扩增）Fig.2 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβ

利用PCR和双酶切的方法，分别筛选出携带β上基因片段和 β下基因片段的阳性重组质粒，见图4。

图3 雌二醇受体β基因后段序列的扩增结果注：2为100 bp ladder分子量标准，1，2，3，和4为阳性扩增）Fig.3 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβNote：1 representmolecular standard of 100 bp ladder，2，3，4，5 represents positive results

图4 pMD18-T-β上和pMD18-T-β下的酶切和PCR鉴定结果Fig.4 Identification of recombinant plasmid ofpMD18-T-β上and pMD18-T-β下

2.4 比格犬雌二醇受体β上基因片段和β下基因片段的测序结果

测序结果表明，比格犬雌二醇受体 β上基因片段的全长为1166 bp，β下基因片段的全长为1024 bp。将两段序列进行拼接，并利用DNAMAN软件分析，其编码框序列为1509 bp，与NCBI数据库预测的10种剪切异构体的结构都不相同，可能为一种新的剪切异构体。1509 bp的编码序列与NCBI数据库中的基因组序列相比，共有5处发生了突变，分别为479处由A→G，导致组氨酸突变为精氨酸；505处由T→C，导致半胱氨酸突变为精氨酸；529处由A→G，导致异亮氨酸突变为颉氨酸；624处由A→G，该突变没有导致氨基酸突变，1031处T→C，导致蛋氨酸突变为苏氨酸。

3 讨论

比格犬雌二醇β受体可能在雌二醇的正反馈作用中发挥重要作用，但目前对该受体结构和功能的信息了解较少。人ERβ可以分成ERβ1～5五个异构型，大鼠的ERβ有三种异构型，而小鼠的ERβ有两种异构型［9，10］。NCBI数据库根据家犬的基因组序列和人的雌二醇受体的剪切异构体信息推测，犬的雌二醇β受体可能存在多种剪切异构体。因此本试验利用两对特异性引物，拟对比格犬雌二醇受体下丘脑、垂体、子宫和卵巢内可能存在的剪切异构体进行了克隆和序列分析。

对下丘脑、子宫和卵巢内比格犬雌二醇受体的扩增克隆结果表明，雌二醇受体存在一种主要的剪切异构体，其分子量的大小与NCBI数据库的预测不同，但测序结果证实这是比格犬雌二醇受体的一种新的剪切异构体。

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