含油废水降解菌的筛选及其除油能力实验

2011-01-31罗晓娟侯明明

环境影响评价 2011年6期

罗晓娟，姜鹏，侯明明，李川

（重庆工商大学废油资源化技术与装备教育部工程研究中心，重庆400067）

石油是由不同的碳氢化合物混合组成的，随着社会经济的发展，石油的使用越来越广泛，由油液产生的环境的污染日益严重。因此减少油液对环境的污染是十分必要的。油液污染的处理方法有机械法、化学法、物理化学法和生物法［1］。而采用生物法减少油液对环境的污染因为其优越性，已经成为研究的热点。生物法是指利用生物体催化降解有机污染物，转化为其他污染物从而消除污染的一个受控或自发进行的过程［2］。生物法具有生产费用低，不产生二次污染，能在原位进行修复等优点，是一项具有发展前景的新技术［3］。本实验以柴油为代表性油液污染物，从含油废水中筛选出一株能以柴油为唯一碳源并生长良好的除油菌，并对其降解条件进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）菌种来源

从含油废水中分离、筛选、驯化而得。

（2）培养基

液体营养培养基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，pH 7.0。

固体营养培养基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，琼脂15.0g／L，pH 7.0。

石油培养基：柴油10g／L，硝酸胺2.0／L，磷酸二氢钾2.0／L，微量元素液：4.0ml／L，pH 7.0。

微量元素液：硫酸镁2.0g，硫酸铜0.5g，高硫酸锰0.5g，硫酸铁0.5g，氯化钙0.5g，水500mL。

1.2 方法

（1）除油菌的筛选及驯化

将10mL含油废水加入到装有90mL无菌水的三角瓶中，30℃，200r／min，振荡30min。对振荡均匀的样品稀释106，107，108倍，取0.1mL稀释液到柴油培养基上，每个稀释浓度重复3次，30℃，恒温培养4～5d。把生长较好的菌落菌株在营养培养基平板上划线并进行连续划线培养，经过多次划线纯化后，直至分离纯化得到单个菌株。纯化后的菌种在柴油培养基平板上划线驯化3～4次，获得柴油降解菌种。将筛选到的柴油降解菌种进行试管斜面培养，并在4℃低温保存。

（2）柴油标准曲线

取0.052g柴油于25mL容量瓶中，用石油醚定容至标线。取5mL该溶液于50mL容量瓶中，用石油醚定容至标线。分别取2，3，4，5，6，7，8，10 mL于比色管中，定容至10mL。采用紫外分光光度法［4］于264nm处测定其吸光度，绘制标线曲线，如图1。其线性回归方程为：Y＝0.3466X＋0.0008，R2＝0.9948。

图1 柴油标准曲线

（4）影响除油菌降解率因素实验方法

将除油菌接种于营养培养基中，培养48h，按5%的接种量接种于柴油培养基中，初始pH值为7.0，初始含油量为10g／L，恒温30℃振荡培养。分别进行以下几组实验，以确定除油菌降解柴油的最佳生长条件。a）将温度分别设定为20，25，30，

（3）除油菌降解率的测定

将驯化后的除油菌接种至柴油培养基中，振荡培养7天后，用紫外分光光度计测定其吸光度，计算出剩余含油量。降解率计算公式：35，40℃（pH值为初始值，培养基为见1.1节），培养7d后测定其降解率。b）将pH值分别设定为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0（温度为室温，培养基为见1.1节），培养7d后测定其降解率。c）将柴油培养基分别配置成氯化铵浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g／L的溶液（温度为室温，pH值为初始值），培养7 d后测定其降解率。d）将培养菌的温度、pH值、氯化铵的浓度都设定为前面3组实验所取得的最佳条件，培养7d后测定其降解率。

2 结果与讨论

2.1 除油菌的筛选

经过平板划线分离培养，筛选驯化出对含油废水具有降解效果的除油菌，其中一株菌种在高含柴油培养基中生长较好，选定为研究菌种。其在10g／L的柴油培养基中，培养3d后的降解率为37%。

2.2 除油菌降解率研究

（1）温度对降解率的影响

温度是微生物的重要生存因素［5］。微生物能生长的温度范围较广，一般在－10℃～95℃都可以生长，但每一种微生物都有其最佳的生长温度［6］。当温度较低时，首先微生物生长缓慢，其次微生物的分解活动需要酶的参与，温度低时，影响酶的活性；当温度较高时，微生物过度生长并使微生物的酶发生变性，从而影响降解率。在微生物生长的最佳温度范围内，微生物的新陈代谢旺盛，对含油废水的处理也较好。同时，温度也影响石油烃类的物理性质和化学组成［7］。从图2可以看出，除油菌的降解率是随着温度的升高而升高的，当温度升高到30℃的时候，降解率是最高的，此后降解率随着温度的升高而降低，所以该除油菌的最佳生长温度为30℃。

图2 温度对降解率的影响

（2）pH值对降解率的影响

微生物的生命活动、物质代谢与pH值密切相关。微生物的细胞膜电荷会随着pH值的变化而变化，这就影响了微生物对营养物质的吸收利用和其在代谢过程中酶的活性。这是因为随着pH值的变化，酶分子上的酸性及碱性氨基酸侧链基团处于不同的解离状态。具有催化活性的基团在总酶量中的比例不同使得酶分子的催化能力也不一样［8］。从图3可以看出，该除油菌在pH值为7.0时，降解率达到了最大值，说明该菌适合在接近中性的环境中生长。

图3 pH值对降解率的影响

（3）氮源浓度对降解率的影响

氮源是作为合成细胞物质和代谢产物中含氮物质的原料，一般不用做能源物质。氮素不足常常会限制生物体的生长繁殖，因此应在培养基中加入适当和适量的氮源以满足生物体的需要［9］。从图4可以看出氮源浓度为1.5g／L时，降解率最大。这是因为氮源不足对菌体生长繁殖及降解功能影响较大。但氮源过量对菌株有一定的抑制作用［10］。