蚕蛹虫草多糖对氢化可的松致小鼠肝损伤的保护作用

1 材料与方法

1.1 药品

蚕蛹虫草多糖。将活化的青海虫草液体菌种(浙江省农业科学院提供)接种于固体培养基(蚕蛹∶玉米面 ∶营养液为 4∶1∶9，营养液:蔗糖 20 g·L－1+蛋白胨 3 g·L－1+ 琼脂 15 g·L－1+ 复合维生素 0.04 g·L－1+MgSO41 g·L－1+KH2PO41 g·L－1)上，按菌液∶培养基 =1∶5比例接种，置于25℃恒温培养箱中培养7 d后，采集培养基表面菌丝体，烘干粉碎，加定量蒸馏水90℃水浴提取4 h，过滤得上清液，加3倍的95%乙醇4℃静置过夜，12 000 r·min－1离心10 min，取沉淀用蒸馏水溶解冻干，得蚕蛹虫草多糖。氢化可的松注射液购自山西晋新双鹤药业有限公司。

1.2 实验动物及环境

ICR小鼠，雄性，体重 (30±2)g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供 (动物饲养合格证号:SCXK浙2008－0033)。环境清洁级，温度(25±2)℃，相对湿度50% ～70%，自然光照，自由取食与饮水，预试期7 d。

1.3 主要试剂与仪器

主要试剂有超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽 (GSH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶 (ALT)以及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。其他化学试剂均为国产分析纯。仪器有infinite M200酶标仪;Leica-DM2500微生物显微镜 (德国，Leica公司)。

1.4 动物造模及用药剂量

小鼠适应性饲养1周后，随机分为4组 (正常对照组，模型组，蚕蛹虫草多糖低、高剂量组(0.2和0.4 g·kg－1))，每组15只。除正常组外，其他各组小鼠每只皮下注射氢化可的松25mg·kg－1，隔日1次，共5次，正常对照组注射等容量生理盐水。末次注射24 h后，按下述分组分别灌药，对照组和模型组每天灌胃0.3 mL生理盐水，蚕蛹虫草多糖给药组每天灌胃0.3 mL相应剂量的蚕蛹虫草多糖 (0.2和0.4 g·kg－1)，连续灌胃21 d。

1.5 检测动物处理方法

实验结束前禁食12 h，各组随机抽取10只小鼠，摘眼球取血，4℃密封静置 2 h，3 500 r·min－1离心 15 min，取血清，4℃密封保存待检。同时迅速剖取肝脏，冰生理盐水冲洗、滤纸吸湿后，称取鲜质量0.3 g左右，加预冷生理盐水，冰水中制成10%匀浆，4℃下12 000 r·min－1离心5 min，取上清液，按试剂盒要求保存待检。

1.6 小鼠血清、肝匀浆的生化指标检测

AST、ALT、SOD、MDA、GSH以及考马斯亮蓝蛋白测试按试剂盒说明书测定。

1.7 小鼠肝脏组织切片标本制备

距肝脏边缘0.5 cm处取材，10%甲醛固定后，逐级乙醇脱水、透明、浸腊、包埋、切片，HE染色。

1.8 统计方法

2 结果与分析

2.1 小鼠血清AST和ALT活性

由表1可见，氢化可的松致肝损伤模型小鼠血清AST和ALT活性显著升高，灌胃给予蚕蛹虫草菌丝体多糖后，可使肝损伤小鼠血清AST和ALT活性显著下降，且呈剂量相关性，其中高剂量菌丝体多糖组 (0.4 g·kg－1)血清 AST、ALT水平与正常组无显著差异。

2.2 小鼠血清GSH、肝脏SOD、MDA水平

表1 试验小鼠血清AST和ALT活性的变化

氢化可的松可造成模型小鼠血清抗氧化剂GSH含量明显下降，肝脏抗氧化酶SOD活性显著降低，MDA含量显著升高;蚕蛹虫草多糖可显著提高肝损伤小鼠血清GSH的含量和肝脏总抗氧化酶SOD活性，降低肝脏MDA含量至正常水平(表2)。

表2 试验小鼠血清GSH、肝脏总SOD酶活性及MDA含量比较

2.3 小鼠肝组织病理变化

病理检查结果显示，正常组小鼠肝组织结构完整，无变性、坏死，肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，细胞核清晰，肝窦正常 (图1中A)。氢化可的松致肝损伤模型小鼠肝小叶结构病变，肝索排列紊乱，细胞间无明显分界，肝窦瘀血，肝细胞广泛性空泡变性，呈典型的气球样变 (图1中B)。蚕蛹虫草多糖低剂量组肝小叶结构有所恢复，肝索部分排列整齐，部分细胞间仍无明显分界，相对模型组有明显好转 (图1中C)。高剂量组肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，细胞核较清晰，肝窦无明显异常，但有少量充血 (图1中D)。

3 小结与讨论

皮质激素氢化可的松造模是应用最广泛的造模方法，大量的实验研究表明，皮质激素动物模型几乎全身所有系统均产生变化，广泛的器官病理损害，脂质过氧化物增加和自由基清除系统功能低下等［8］。AST和 ALT是肝损伤的标志酶，在正常条件下，这些酶主要存在于细胞核和线粒体内，当细胞膜受到损伤时就会释放入血，故血清中AST和ALT酶活性的升高为反映肝功能受损的特异性指标［9－10］。病理切片发现氢化可的松可造成小鼠肝索排列紊乱，细胞间无明显分界，肝窦瘀血等病变［11］。本实验从血清学和肝组织理学2方面说明小鼠肝损伤造模成功。

图1 蚕蛹虫草多糖对氢化可的松致肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响 (HE×10)

前期的研究发现许多多糖具有显著的肝功能保护作用［12］。孙延鹏［13］等研究发现山药多糖可降低血清中AST和ALT活性，对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用。陈旭等［14］发现桃金娘多糖对 D-半乳糖胺致大鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。本实验发现，氢化可的松可导致小鼠血清AST和ALT活性显著升高，说明模型小鼠肝损伤明显;灌胃给予蚕蛹虫草菌丝体多糖后，可使肝损伤小鼠血清AST和ALT活性显著下降，且呈剂量相关性，其中高剂量菌丝体多糖组 (0.4 g·kg－1)血清AST、ALT水平与正常组无显著差异，说明蚕蛹虫草多糖对氢化可的松致小鼠肝损伤具有明显的保护作用。

脂质过氧化是机体分子氧在氧化代谢过程中形成的活性氧中间产物，是对生物膜磷脂中多不饱和脂肪酸攻击引起的细胞损伤过程［15］。MDA是反映机体脂质过氧化水平的重要指标，其能与蛋白质的巯基反应，导致被修饰的蛋白质和酶失去生物活性，而SOD和GSH是机体内2个关键的抗氧化剂［15］。本实验研究发现，氢化可的松在引起脂质过氧化同时，减弱体内内源性抗氧化酶 (SOD)的活性及GSH含量，致使大量自由基无法清除，MDA水平显著升高，进而引起肝细胞结构及功能损伤;虫草多糖可明显提高抗氧化剂 (SOD、GSH)的水平，降低MDA含量，从而减轻了因脂质过氧化加剧而造成的肝细胞损伤。肝脏石蜡切片观察发现蚕蛹虫草多糖明显减轻了氢化可的松引起的肝小叶结构紊乱、肝窦淤血及肝索排列紊乱等病理变化，显示出对氢化可的松造成的肝细胞损伤具有明显的保护作用。本研究结果为进一步了解蛹虫草多糖对肝损伤保护机制以及蛹虫草的深度开发提供了基础信息。

［1］林群英，宋斌，李泰辉.蛹虫草研究进展［J］.微生物学通报，2006，33(4):154－157.

［2］廖春丽，王莲哲，王福梅.蛹虫草多糖的研究进展［J］.中国科技信息，2009(1):169，171.

［3］梁莉，王婷，乔华，等.南沙参多糖对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞保护作用的研究［J］.中国药房，2007，18(24):1853－1855.

［4］段小群，焦杨，张士军，等.玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用［J］.时珍国医国药，2007，18(7):1592－1593.

［5］李怡芳，曾怀苇，王敏，等.金针菇多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.广州药学院学报，2010，26(2):162－165.

［6］徐晓燕，张志港，辛小明，等.牛膝多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用［J］.泰山医学院学报，2010，31(2):97－99.

［7］汤晓云，姜云武，方路，等.氢化可的松诱导的几种动物模型［J］.云南中医中药杂志，2005，26(2)，56－58.

［8］施明珠，李有贵，钟石，等.蛹虫草菌丝体醇提物对氢化可的松致小鼠肝损伤的保护作用［J］.中草药，2009，40(2):262－265.

［9］汤新慧，高静.实验性肝损伤的损伤机制［J］.中西医结合肝病杂志，2002，12(1):53－55.

［10］ Girott AW.Lipid hydroperoxide generation， turnover， and effector action in biological systems ［J］.J Lipid Res，1998，39(8):1529.

［11］胡宗礼，黄晓萍.虎杖方剂对四氯化碳致大鼠肝损伤的保护作用研究［J］.时珍国医国药，2009，20(3):657－658.

［12］宋江峰，刘春泉，李大婧，等.北冬虫夏草多糖活性研究进展［J］.江苏农业科学，2006(4):145– 148.