香烟提取物对人支气管上皮细胞表达 β-防御素 2的作用研究

刘蔺 王开绿 黄玲 李文军 郑晓凤 刘艳群 蒙琴

香烟提取物对人支气管上皮细胞表达 β-防御素 2的作用研究

刘蔺 王开绿 黄玲 李文军 郑晓凤 刘艳群 蒙琴

目的 探讨香烟提取物(CSE)对人支气管上皮细胞表达人β防御素2(hBD2)的影响。方法 利用不同浓度(4%和8%)的CSE刺激人支气管上皮细胞(16HBE),分别于0、6、12、24、48 h收集细胞总蛋白,运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定hBD2的蛋白表达水平。结果 4%和8%CSE均诱导16HBE于6、12、24、48 h进行性hBD2表达下降。8%CSE干预组变化幅度大于4%CSE干预组。结论CSE抑制人支气管上皮细胞表达hBD2,此机制可能参与香烟对气道防御的抑制作用。

β防御素2;香烟提取物;支气管上皮细胞

吸烟是慢性阻塞性肺疾病(COPD)最重要的环境致病因素。研究发现 β防御素 2(BD 2)作为一种抗微生物肽,在黏膜上皮(包括气道上皮)炎症-免疫防御中起重要作用[1]。本实验目的在于探讨香烟提取物(CSE)对人支气管上皮细胞表达人β防御素2(hBD2)的直接影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人支气管上皮细胞株(16HBE)由四川大学华西医院呼吸病学研究室提供,DMEM细胞培养基(高糖)购自美国英杰(Invitrogen)生命技术有限公司;hBD 2酶联免疫吸附法(ELISA)测试盒购自美国ADL公司;细胞总蛋白提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 香烟提取物(CSE)制备 参照Taussat的方法[2]制备CSE,每只香烟(尼古丁:1mg;焦油:14mg)完全燃烧产生的烟雾溶于5ml无血清DMEM培养基中,用无菌滤过器进行无菌化处理(0.22 um孔径滤过膜除菌),其定为100%CSE母液,pH值调至7.4,超低温(-80°C)保存备用。

1.3 细胞培养与实验分组[3]16HBE细胞按1×106个细胞接种于 25 cm2培养瓶中,取指数生长期细胞用于实验。实验分为①对照组:用无血清DMEM培养基培养细胞;②4%CSE干预组:用含4%CSE无血清DMEM培养基培养细胞;③8% CSE干预组:用含8%CSE无血清DMEM培养基培养细胞。

蛋白提取与 hBD 2表达测定:对照组和干预组分别于 0、6、12、24、48h收集细胞总蛋白,实验重复 3次。总蛋白提取与定量均按照试剂盒说明进行。hBD 2蛋白表达水平按ELISA试剂盒说明进行,每个样本均测试 2次,以2次的平均值为最终值。

2 结果

实验结果显示(见表1):相对于对照组的hBD2表达水平(基线水平),CSE刺激支气管上皮细胞6 h后,hBD 2的蛋白表达在4%、8%两个不同浓度CSE刺激组均呈时间依赖性下降,尤其8%CSE组下降更为显著(P＜0.05)。至48 h, hBD2的蛋白表达(4%:246±28;8%:220±19 pg/mg)均显著低于正常对照水平(P＜0.01)。

表1 不同浓度CSE对16HBE细胞表达hBD2的影响（±s,n=3,pg/mg)

表1 不同浓度CSE对16HBE细胞表达hBD2的影响（±s,n=3,pg/mg)

注:*与对照组比较P＜0.05;#与4%CSE组比较P＜0.05

组别 0 h 6 h 12 h 24 h 48 h对照组 341±22 342±11 340±30 335±19 323±24 4%CSE组 341±34 310±31* 291±15* 278±36* 246±28* 8%CSE组 342±16 287±44*# 263±30*# 233±24*# 220±19*#

3 讨论

COPD是一种以肺部表现为主要特征的全身性疾病。在我国,COPD具有高发病率、高致残(死)率的特点,严重危害国人的生命健康[4]。COPD的发病机制复杂,多因素(包括环境因素和遗传因素)参与其中,吸烟被认为是COPD最重要的环境致病因素。研究发现香烟烟雾中含有超过 4000种高浓度的氧化剂。反复香烟烟雾刺激可导致气道以及肺部炎症反应和免疫损伤,以致于更易受病原微生物的侵袭,从而导致气道及肺部反复感染,并最终造成肺结构不可逆破坏[5]。研究证明上皮细胞不仅通过物理屏障作用抵御外来病原微生物,而且还可以通过合成和分泌抗微生物肽在内的多种细胞因子,杀灭病原微生物。在上述过程中,抗微生物多肽扮演重要的防御作用,其中防御素(尤其 BD 2)在气道炎症-免疫防御体系中具有重要作用,hBD2被证明广泛表达于全身的黏膜上皮(包括气道上皮),在黏膜的防御上起重要作用[6]。王卓等报道,与正常对照相比,稳定期与急性加重期COPD患者诱导痰中 hBD 2的表达水平均有所降低,尤其在急性加重期更为明显[7],以上研究提示COPD患者气道防御系统损伤与hBD2表达下降密切相关,但香烟是否直接抑制气道上皮细胞表达hBD 2,进而促进香烟导致的气道损伤,目前尚无明确定论。既往的研究发现,香烟烟雾及香烟提取物可抑制人鼻窦上皮及牙龈上皮细胞表达 hBD 2[8,9],李明等报道CSE可抑制脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(A 549)hBD2的表达[10], Herr等研究表明吸烟人群痰液中的hBD2表达水平低于不吸烟人群[11]。本实验结果显示:CSE刺激16HBE,hBD2的表达水平出现时间依赖性下降。该结果说明香烟烟雾对人气道上皮表达 hBD 2的直接作用表现为抑制。由此可见,本实验结果与国内外相关研究结果一致,提示此机制在香烟对气道防御的损伤过程中具有重要作用。但必须指出,由于COPD的发病机制十分复杂,所以不可能单纯从吸烟的角度去阐释其中的全部机制,而且目前的实验模型也不可能模拟COPD的全部特征。由此可见,hBD 2在COPD气道防御中的重要作用仍需要进一步的研究阐释。

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Effect of Cigarette Sm oke Extract onβ-defensin 2 Expression by Human Bronchial Epithelial Cell (16HBE)

LIU Lin,WANGKai-lu,HUANGLing,etal.

Departmentof RespiratoryMedicine,the Third People's Hospital of Mianyang621000,China

Objective To investigate the effectof cigarettesmoke extract(CSE)on humanβ-defensin2 (hBD2)expression by human bronchial epithelial cell(16HBE).Methods 16HBE cellswere incubated with two different concentrations of CSE(4%and 8%),and the cell protein was harvested at the experimental timepoints of0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,respectively.ELISA was used to assess the hBD2 protein expression level. Results After CSE(4%and 8%)stimulation,the hBD2 expression level significantly decreased at6 h,12 h, 24 h,48 h timepoints time-dependently,compared with the control.The expression of hBD2 in CSE 8%group had a larger change extent than CSE 4%group.Conclusion CSE suppresses hBD2 expression by 16HBE cells,and thismechanism may contribute to the inhibition ofairway defense by cigarette smoke.

β-defensin 2;Bronchialepithelial cell;Cigarette smoke extract

621000绵阳市第三人民医院呼吸科

刘蔺 Email:liulin528@126.com