超高效液相色谱-串联质谱法测定稻田水体中的甲磺隆、苄嘧磺隆残留

杨 俊,王文辉,王 齐,孙晓东

(昆明理工大学分析测试研究中心,云南昆明 650093)

甲磺隆(metsulfuron-methyl)和苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)是磺酰脲类除草剂,具有高效、广谱、低毒、用量少、易降解等特点,被广泛用于长江流域及其以南地区稻田杂草的防治[1-2]。它们能有效抑制杂草的危害,但除草剂残留,以及对农业环境的危害也日益严重。除草剂的毒性虽然比一般的杀虫剂低得多,但长期大量使用,使其在农作物体内、土壤、水体中残留,又通过食物链危害整个生态系统的安全。因此,对环境中除草剂残留进行分析检测就显得尤为重要。苄嘧磺隆及甲磺隆对稗草、矮慈菇、四叶萍等具有较好的防治效果,是目前移栽稻田较理想的一次性除草剂。但由于它是选择性内吸除草剂,残留时间较长,如果水体中该药残留较高,作物易发生药害,同时也会随着农田污水的排放进入整个环境水体,危害生态系统安全。

目前,检测甲磺隆和苄嘧磺隆类化合物的方法有生物测定法[3]、酶联免疫分析(ELISA)法[4-5]、气相色谱法[6]、高效液相色谱法[7-8]和毛细管电泳法[9]。生物测定法具有费用小、操作简单、精度高、能反映对植物综合效应等优点,但其缺乏专一性,重现性差。酶联免疫分析是一种快速、有效、专一性强的检测方法,但其检测范围仅为20～100 mg/kg,达不到农药残留检测限的要求。气相色谱法是农药残留分析的经典方法,但由于磺酰脲类除草剂挥发性低,且对热不稳定,使该类化合物的直接测定受到限制,通常要进行如偶氮甲烷衍生化、溴化戊氟苄基衍生化或水解成芳基磺酰胺等各种衍生化后,才可用气相色谱法进行分析,所以该方法没有被广泛用于磺酰脲类除草剂的残留分析。毛细管电泳法由于要求进样体积低而达不到分析方法的灵敏度要求。磺酰脲类化合物具有不易挥发、对热不稳定的特点,对这类化合物的测定高效液相色谱优越于气相色谱,所以液相色谱法是目前分析磺酰脲类化合物最常用的方法,但带紫外检测器的高效液相色谱法存在灵敏度低,最低检出限只能达到0.3 μg/L,缺乏专一性,需要很多净化前处理。本工作采用质谱作为检测器,利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法分析磺酰脲除草剂的痕量残留。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪:美国Waters公司产品;Acquity UPLC-Quattro Premier三重四极杆串联质谱仪:美国Waters公司产品,配备电喷雾离子源(ESI),以及Masslynx 4.1数据采集软件;Supelco C18固相萃取柱(500 g/3 L):美国 Supelco公司产品。

甲磺隆、苄嘧磺隆(纯度不小于98.0%):美国Sigma公司产品;乙腈(色谱纯):美国 Fisher公司产品;乙酸为分析纯;实验用水为超纯水;稻田水样:由云南省农业科学院农环所提供。

1.2 标准溶液的配制

50.0 mg/L甲磺隆、苄嘧磺隆标准储备液:分别精密称取5.0 mg甲磺隆、苄嘧磺隆,用乙腈溶解,定容至100 mL容量瓶中,摇匀,4℃保存 ,待用。

0.5 mg/L混合标准溶液:分别移取1.0 mL,甲磺隆、苄嘧磺隆标准储备液,用乙腈定容至100 mL容量瓶中,摇匀。

1.3 色谱条件

色谱柱:Acquity UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7μm);流动相:A液为0.05%乙酸,B液为甲醇;流速0.4 mL/min,梯度洗脱程序列于表1;柱温30℃;进样量10μL。

表1 流动相梯度表Table 1 G rade table of mobile phase

1.4 质谱条件

ESI+离子化,毛细管电压3.00 kV,锥孔电压20 V,二级锥孔电压3 V,碰撞电压0.2 V,离子源温度120℃,脱溶剂气温度350℃,脱溶剂气流速800 L/h,锥孔反吹气流量20 L/h,其他参数列于表2。

表2 甲磺隆、苄嘧磺隆的质谱参数Table 2 Optimized MS parameters of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl

1.5 样品前处理

量取20.0 mL水样(若水样混浊,则先用0.45μm滤膜过滤),用1 mol/L盐酸调节p H 2.5,依次用5 mL乙腈和5 mL超纯水活化固相萃取小柱;然后加入20.0 mL待测水样,待水样加完后,减压抽干小柱,再用6 mL乙腈洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干;加乙腈定容至1.0 mL,供LC/MS测定。

2 结果和讨论

2.1 液相色谱条件的建立

UPLC采用的色谱柱填料粒径为1.7μm,与常规的5μm C18色谱柱相比,能显著提高柱效,大大减少色谱分离所需的时间,并且其所使用的0.2～0.4 mL/min流速又恰好能与电喷雾离子化方式所匹配。

在流动相的选择方面,分别采用了等度洗脱(70%甲醇-0.05%乙酸)和梯度洗脱两种方式。除了考虑色谱的分离情况,还要考虑是否与质谱条件匹配。实验比较了甲醇-0.05%乙酸和乙腈-0.05%乙酸,发现采用等度洗脱方式虽然能够很好的分离甲磺隆和苄嘧磺隆,但其峰型较差,示于图1;而采用梯度洗脱方式,甲磺隆和苄嘧磺隆的分离度和峰型均较好,故采用梯度洗脱方式进行甲磺隆和苄嘧磺隆的分离,示于图2。

2.2 质谱条件的建立

通过对甲磺隆(C14H15N5O6S)和苄嘧磺隆(C16H18N4O7S)的结构分析,相对分子质量分别为381.4和410.4,母离子分子离子峰[M+H]+分别为 m/z382.4和 m/z411.4。采用直接进样方式将质量浓度为0.5 mg/L甲磺隆和苄嘧磺隆混合标准溶液注入离子源中,在正离子检测方式下分别进行母离子全扫描,得到甲磺隆和苄嘧磺隆的母离子峰。分别对两者的一级质谱参数(如毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流速等)进行优化,使甲磺隆和苄嘧磺隆母离子的离子强度达到最佳,然后以此母分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描,采集全扫描的二级质谱图,得到相应的碎片离子信息,对二级质谱参数(如碰撞电压,碰撞气流速等)进行优化,使特征碎片离子产生的离子对强溶剂气流速等优化,以使甲磺隆和苄嘧磺隆的母离子的离子强度达到最佳,得到的甲磺隆和苄嘧磺隆二级质谱图分别示于图3、图4。选择m/z381.9＞m/z167.0作为甲磺隆定性、定量离子,m/z411.0＞m/z149.1作为苄嘧磺隆定性、定量离子。

图1 甲磺隆、苄嘧磺隆等度洗脱色谱图Fig.1 Chromatography of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl with isocratic elution

图2 甲磺隆、苄嘧磺隆梯度洗脱色谱图Fig.2 Chromatography of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl with gradient elution

2.3 固相萃取条件的优化

由于在酸性条件下,弱酸性的甲磺隆和苄嘧磺隆以分子状态存在,易与固相萃取柱中的固相材料结合,从而保留在固相萃取柱中,因此过柱之前将样液调至p H 2.5。

比较乙腈和甲醇的洗脱效果,实验发现,用甲醇作为洗脱液时,其待测组分的回收率较乙腈低,故选用乙腈作为洗脱液。

图3 甲磺隆的 ESI-MS/MS质谱图Fig.3 ESI-MS/MS mass spectrum of metsulfuron-methyl

图4 苄嘧磺隆的ESI-MS/MS质谱图Fig.4 ESI-MS/MS mass spectrum of bensulfuron-methyl

洗脱液体积的优化:为了确定乙腈洗脱液的用量,采用在空白水样中加标,用10.0 mL乙腈按 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 分段洗脱并收集,吹干后定容至1.0 mL,进行色谱分析。实验表明,在洗脱液体积为6.0 mL时,检测不出甲磺隆和苄嘧磺隆,故固相萃取时,乙腈的用量为6.0 mL。

2.4 标准曲线

分别移取 0.2、2.0、10.0、20.0 mL 甲磺隆、苄嘧磺隆混合标准溶液,用乙腈定容至100 mL,配成 1.0、10.0、50.0、100.0、500.0μg/L 含甲磺隆和苄嘧磺隆的混合标准溶液。经UPLC-MS/MS测定后,分别以甲磺隆和苄嘧磺隆为定量离子,色谱峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到甲磺隆的回归方程为y=788.73x-3 653,r=0.999 7,苄嘧磺隆的回归方程为y=508.64x-1 291.3,r=0.999 9。甲磺隆和苄嘧磺隆在1.0～500.0μg/L的范围内线性关系良好。

2.5 检出限

取20.0 mL水样分析,最终定容体积为1.0 mL,进样量10μL,在空白水样品中添加甲磺隆和苄嘧磺隆标准溶液,测得稻田水体中甲磺隆和苄嘧磺隆的检出限(S/N=3)分别为0.002 5μg/L和0.005μg/L。

2.6 回收率和精密度

分别准确吸取0.1、0.2、0.4 mL甲磺隆、苄嘧磺隆混合标准溶液,用空白水样定容至20 mL,按2.5项方法制备供试液,进行色谱及质谱条件的测定,计算甲磺隆和苄嘧磺隆的回收率以及测定结果的相对标准偏差,每组样品平行测定6次,结果列于表3。由表3可知,在添加水平2.5～20.0μg/L时,其回收率为 87.6%～98.2%,相对标准偏差为1.6%～3.5%。空白水样加标的UPLC-MS/MS总离子流色谱图,示于图5。

2.7 样品测定

应用本方法检测从稻田中采集的10批水样,样品中甲磺隆和苄嘧磺隆的含量为0.75～10.2μg/L,结果列于表4。

表3 标准加入空白水样中甲磺隆和苄嘧磺隆的回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recovery and RSD of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl in the samples of standard addition(n=6)

图5 空白水样加标的UPLC-MS/MS总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatograms of a blank sample spiked standard

表4 不同水样中,甲磺隆和苄嘧磺隆残留量检测结果Table 4 Results of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl contents in some selected paddyfield w ater

3 结论

本方法适用于同时检测稻田水体中甲磺隆和苄嘧磺隆的残留。实验表明,UPLC-MS/MS对于稻田水体中甲磺隆和苄嘧磺隆的残留分析,是一种灵敏度高、重现性好的定性、定量方法。在水样只有20倍浓缩的情况下,检测限可达0.002 5μg/L和0.005μg/L,可以通过加大处理水样的量继续降低检测限。

[1]邓金保.磺酰脲类除草剂综述[J].世界农药,2003,25(3):24-29.

[2]司友斌,张 瑾,岳永德,等.除草剂苄嘧磺隆在环境中的降解转化研究进展[J].安徽农业大学学报,2002,29(4):359-362.

[3]SCHLAEPPIJ A,KESSLER A,FORY W.Development of a magnetic particle based automated chemiluminescentimmunoassay fortriasulfuron[J].J Agric Food Chem,1994,42(9):1 914-1 919.

[4]L EE J K,AHN K C,PARK O S.Development of an immunoassay for the residues of the herbicide bensulfuron-methyl[J].Journal ofAgricultural Food Chemistry,2002.50(7):1 791-1 803.

[5]YAZYNINA E V,ZHERDEV A V,EREMIN S A.Development of enzyme immunoassays for the herbicide chlorsulfuron[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2002,38(1):9-14.

[6]吴 岩,杨长志,刘 永,等.气相色谱-质谱法测定大豆中的豆磺隆的残留量[J].分析试验室,2008,27(3):80-83.

[7]刘海燕,黄 超.甲磺隆-氯磺隆-噻吩磺隆混剂液相色谱分析[J].农药科学与管理,2005,26(12):5-7.

[8]何成艳,黎源倩,王和兴.固相萃取-高效液相色谱测定水中5种磺酰脲类除草剂[J].现代预防医学,2008,35(3):538-540.

[9]谢晓悔,廖 敏.毛细管电泳定量测定稻田土壤中痕量磺酰脲类除草剂残留[J].农药学学报,2004,6(2):57-61.