强心饮对心肌病大鼠模型细胞凋亡因子的影响

严 骅 高俊杰

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)

近年研究发现，心肌细胞的持续丢失是心力衰竭发展进程中最主要的因素，而心肌细胞凋亡可能就是其持续丢失的根源所在［1,2］。强心饮是名老中医经验方，标本兼顾，在临床上应用于心肌病心力衰竭患者治疗，疗效明显，但对其作用机制尚未进行过研究。本研究运用阿霉素制备心力衰竭大鼠模型，观察强心饮对模型大鼠心肌细胞凋亡的作用，探讨该药对防治心肌病心力衰竭的可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

选择80只体质量180～200g的SPF级Wistar雄性大鼠（上海中国科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（沪）2007-0005；饲养于上海中医药大学实验动物中心，合格证号SYXK（沪）2009-0069）。

1.2 药物

强心饮由附子、茯苓、白术、白芍、仙灵脾、补骨脂、炙鳖甲等组成，总剂量173g，均购自上海中医药大学附属曙光医院中药房，按处方比例称取中药材，加水煎煮、浓缩，取上清，置4℃备用；培哚普利（施维雅，批号9D0437）；灭菌注射用生理盐水均为市售品；盐酸阿霉素粉针（浙江海正药业股份有限公司，批号091001）。

1.3 试剂与仪器

BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；大鼠Bcl-2、BAX ELISA试剂盒均由西唐生物技术研究所提供。DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪，芬兰；GE心动超声仪Vivid i S/N及探头10S-RS，美国；奥林巴斯显微镜DP71，日本；Leica TcsSP2型激光共聚焦扫描显微镜，德国。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

Wistar雄性大鼠80只，除空白对照为10只大鼠外，余组数量相同。将盐酸阿霉素粉针用灭菌注射用生理盐水配成浓度为1mg/mL的阿霉素溶液（避光）。除空白对照组外，其余各组大鼠分别于每周尾iv阿霉素溶液2mg/kg，共6周造模。空白对照组ip等容积生理盐水。各治疗组在注射阿霉素同时，开始ig强心饮低、中、高剂量组（分别为含生药4.325g/kg、8.65g/kg、17.3g/kg）和培哚普利4mg/（kg·d）；空白对照组和模型组给予同体积蒸馏水ig。

1.4.2 取材

治疗结束后，用25%乌拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，应用心动超声仪分别测量血流动力学。然后心脏采血，摘取左心室，洗净，以备后续实验。

1.4.3 TUNEL法检测凋亡细胞

切取部分左心室组织制作组织切片，用4%多聚甲醛液固定，常规制作切片。使用CHEMICON international ApopTag® Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit S7110试剂盒。采用dUTP介导的末端标记技术原位检测凋亡心肌细胞。激光共聚焦扫描显微镜观察标记结果：凋亡细胞的形态特征为核中有荧光染色颗粒。

1.4.4 BCA蛋白浓度测定

组织匀浆制备：冰浴下迅速剪取部分左心室组织，置冰冻组织于离心管，按每200mg加入1mL匀浆介质中（PH7.4，0.01mol/L Tris-HCL，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/Lsugar），冰浴电动匀浆，处理3～4min后，冰浴10min，振荡，4℃，12000 r/min离心15min，取上清备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定组织蛋白浓度。酶标仪562nm处测定。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

1.4.5 凋亡因子检测

采用ELISA法检测大鼠胞浆Bcl-2，BAX含量。检测方法参照试剂盒说明书。

1.4.6 统计方法

2 结 果

2.1 强心饮对心肌损伤有保护作用

我们的前期研究结果表明，强心饮能够通过调节模型大鼠的部分神经内分泌指标的过度增高，从而减轻心肌重构，改善心功能，保护心脏[3,4]。

2.2 强心饮对心肌细胞凋亡影响

心肌凋亡免疫荧光结果显示：空白对照组细胞凋亡数很少，基本很难检测到阳性信号（图1-A）；阿霉素造模6周后，模型组凋亡明显增加（图1-B），与模型组相比：培哚普利组、强心饮组细胞凋亡数较模型组明显减少（图1-C、D）。

2.3 强心饮对心肌Bcl-2、Bax含量的影响

见表1。与空白对照组比较，模型组Bcl-2含量明显降低，而Bax含量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，培哚普利组和强心饮高剂量组的Bcl-2含量明显提升（P＜0.05）；强心饮各剂量组的Bax含量均明显下降（P＜0.05、P＜0.01）；各治疗组的Bcl-2/Bax比值较模型组显著提高（P＜0.01）。

图1 强心饮对心肌细胞凋亡TUNEL表达的影响（x200）

表1 对各组大鼠CytC、Bcl-2、BAX含量的影响（±s）

表1 对各组大鼠CytC、Bcl-2、BAX含量的影响（±s）

注：与模型组比较 1）P＜0.05，2）P＜0.01

组别 剂量(g/kg) n Bcl-2(pg/mg) BAX(Pg/mg) Bcl-2/BAX空白 — 10 29.48±3.18 1） 25.99±7.57 1） 1.21±0.11 2）模型 — 9 22.76±1.62 34.26±7.57 0.70±0.06培哚普利 2× 10 31.11±8.54 1） 29.57±9.64 1.13±0.112）强心饮低 10-3 10 25.68±4.62 24.97±4.982） 1.05±0.072）强心饮中 4.325 10 23.96±3.57 23.72±3.642） 1.03±0.062）强心饮高 8.65 10 29.83±12.15 1） 26.77±7.30 1） 1.08±0.192）17.3

3 讨 论

心力衰竭是心脏病的危重阶段，多数患者常因心力衰竭进行性加重而死亡或因心律心常而发生猝死，因其发病率及病死率高而成为亟待解决的难题。在中医学中，并无心肌病心力衰竭之病名，但有类似症状的描述，根据患者的临床表现，此病可归于中医“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“喘证”“痰饮”“水肿”之范畴。心主血脉，心藏血脉之气，血脉之运行依赖于心阳、心气温煦和推动。心力衰竭多病重日久，致心气阳虚，心主血脉功能失司，血脉瘀阻。而久病及肾，亦可致命门火衰，不能温煦心阳，则致君火更衰。可见，本病重在阳气亏虚，并由此继发水饮瘀血等标实之候，且水饮瘀血一经产生，再伤阳气，而致阳气更虚，故本病为本虚标实之候，且虚实错杂，多脏受累，缠绵难愈。强心饮以温补心肾、利水化痰消瘀为治疗原则，标本兼顾，在临床上收到了良好的疗效。

我们选择采用大鼠尾静脉注射阿霉素复制心慢性力衰竭模型，造模时间为6周，使心肌和心功能慢性损害更接近临床[5]。本实验结果表明，当大鼠尾静脉间断注射小剂量阿霉素而出现心肌病心力衰竭时，大鼠的心肌细胞凋亡明显增多，而空白对照组大鼠的心肌细胞凋亡数量极少。用强心饮干预的大鼠，心肌细胞凋亡的数量也较模型组明显减少。这一结果证实心肌细胞凋亡与心肌病心力衰竭的发生发展有密切关系。

在细胞凋亡中，线粒体被认为是起着中央调控作用[6]。现在普遍认为，在对细胞线粒体的调控中，Bcl-2家族的Bcl-2和BAX起着重要的作用。Bcl-2位于线粒体的内外膜交接处的抗凋亡蛋白，抵抗细胞凋亡。相反Bax作为一种促凋亡蛋白，一旦接受细胞凋亡信号时构象发生变化，导致线粒体内物质的释放。又有实验证实，Bcl-2和BAX等具有成孔性质，可直接调节线粒体膜的通透性[7]，它们的表达比例变化可影响线粒体内的促凋亡物质流入胞浆而引发细胞凋亡。

从本实验结果可以看出，与空白对照组相比，模型组Bcl-2含量下降，Bax含量升高，而强心饮治疗组及培哚普利组Bcl-2升高、Bax降低，Bcl-2与Bax的比例较模型组有显著的提高。由此可见，强心饮通过调控Bcl-2和Bax的平衡，起到阻止细胞凋亡的发生、延缓或改善心肌重构的发生及发展的作用。其更详细的作用机制，还有待于进一步的深入研究。

[1]Yamada T,Matsumori A,Wang WZ,et al.Apoptosis in congestive heart failure induced by viral myocarditis in mice[J].Heart vessels,1999,14(1)：29.

[2]Colucci WS.Molecular and cellular mechanisms of myocardial failure[J].Am J Cardiol,1997,80(11A)：15.

[3]严骅,高俊杰,蒋梅先,等.强心饮对阿霉素心肌病心力衰竭大鼠模型心肌重构的影响[J].上海中医药大学学报,2010,24(3)：65.

[4]严骅,高俊杰,蒋梅先,等.强心饮对阿霉素诱导大鼠慢性心肌损伤的保护作用[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(7)：557.

[5]McFalls EO,Paulson DJ,Gilbert EF,et al.Carnitine protection against adriamycin-induced cardiomyopathy in rats[J].Life Sci,1986,38(6)：497.

[6]Newmeyer DD,Ferguson-miller S.Mitochondria：Releasing power for life and unleashing machineries of death[J].Cell,2003,112(4)：481.

[7]Jia L,Srinivasula SM,Liu FT,et al.Apaf-1 protein deficiency confers resistance to cytochrome c-dependent apop tosis in human leukemia cells[J].Blood,2001,98(2)：414.