穴位注射复方丹参液对大鼠跟腱病组织修复的实验研究

马 玲，郑志新，蒋崇博，王 军

解放军总医院康复医学科，北京 100853

跟腱病（achilles tendinopathy）是小腿劳损综合征中最常见的一种，可由跟腱周围的慢性炎症、劳损而引起疼痛[1]，与跑步运动有直接关系，能够潜在性削减运动能力，是一种处于退变状态的病变。跟腱病可导致跟腱断裂等多种继发性损伤，严重影响运动能力，越来越被临床医生所重视，因此，对该病进行早期干预十分重要。祖国医学在该病治疗方面，独具特色的是运用针灸、中药在中医基础理论指导下对该病的辨证施治，临床证明，作为一种独特治疗方法的穴位注射疗法，危险性小，并可通过药物作用以及针灸的活血化瘀、通经活络、解痉止痛等作用而促进病变症状的消除和运动能力的恢复。然而这些工作多局限于临床观察，针对跟腱病的基础研究还比较少。本研究以中医基础理论为指导，用穴位注射复方丹参注射液，探讨穴位注射治疗跟腱病的作用机制，为临床应用提供理论依据，并且为防治跟腱病提供更为有效的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物由北京军事医学科学院动物实验中心提供。动物选用健康2月龄雄性SD大鼠60只，体重（217±17）g。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将60只健康2月龄雄性SD大鼠中随机选取10只设为空白对照组（Ⅰ组），其余的行跟腱病造模后随机分为阳性对照组（生理盐水对照，Ⅱ组）和复方丹参注射液治疗组（Ⅲ组），每组各25只。

1.2.2 模型置备 适应性喂养1周后，在60只大鼠中随机选取50只进行造模，具体操作方法：3%戊巴比妥钠（1.42 ml/kg）腹腔注射麻醉满意后，大鼠取俯卧位，左小腿备皮，碘伏消毒，铺洞巾。取左侧跟腱后正中切口，自近端向远端纵行切开皮肤、皮下组织，切口远端至跟骨结节，近端至小腿三头肌与跟腱交界处，暴露亮白色的跟腱全段，在直视下使用装有1%Ⅰ型胶原酶（130 μl/kg）的 30 μl微量注射器，于跟骨结节后上缘中点处沿跟腱轴线方向进针平推入跟腱，进针长度为3 mm。间断缝合切口，并医用酒精纱布包扎切口，术后腹腔注射青霉素（2.7万U/kg）1次，以预防感染。造模3周后，随机抽样处死后确认已建立大鼠跟腱病模型。取其跟腱组织行HE染色光镜观察，以证实造模成功。

1.2.3 1%大鼠Ⅰ型胶原酶的制备 用电子秤称取大鼠Ⅰ型胶原酶粉剂30 mg，置于小烧杯中，向小烧杯中加入生理盐水3 ml，用玻璃棒搅拌使其溶解，制成1%Ⅰ型胶原酶溶液。整个配制过程均在无菌环境下完成。将所配制的溶液分装于EP管并置于-20℃冰箱中贮存备用。

1.3 取穴及治疗

穴位的定位选取根据林文注等主编的《实验针灸学》[2]，并以比较解剖和骨度分寸法为依据。阳陵泉：相当于人体“阳陵泉”的膝下外侧腓骨小头前下方凹陷处。承山：相当于人体“承山”的腓肠肌两肌腹分开的下端凹陷处。昆仑：相当于人体“昆仑”足部外踝后方，当外踝尖与跟腱之间凹陷处。

在造模成功后，治疗组选取大鼠取俯卧位，左下肢常规消毒，以配5号针头的1 ml注射器吸取复方丹参注射液0.3 ml，对大鼠左下肢的阳陵泉、承山、昆仑三穴直刺，深度3～5 mm，回抽无血后，注入复方丹参注射液0.1 ml/穴，用时4～5 s，1次/2 d，10 d为一疗程，连治2个月。对照组选用大鼠同样取阳陵泉、承山、昆仑三穴，注射生理盐水0.1 ml/穴，1次/2 d，10 d为一疗程，连治2个月。空白组大鼠不予任何干预，正常喂养。

1.4 步态检测

将受检大鼠的双足底用红色无毒油泥染色，并将大鼠置于100 cm长、鼠身宽的狭长直通道内行走，大约描记出14个足印（左右各7个），从所描记出的左右足的足印中段各选出两只相邻足印，然后测量出大鼠双侧足印的步长、足长、全趾宽和中间趾宽，作为步态检测的原始数据，留待功能指标换算使用。

1.5 取材和固定

具体方法如下：观察造模时的切口情况后，将大鼠俯卧位固定于鼠夹上，常规消毒大鼠培养瓶中小腿皮肤，取自小腿中段至跟骨结节的后正中切口，切开皮肤、皮下组织，游离皮肤，保存完整的跟腱周围组织，暴露整个跟腱，生理盐水冲洗，用手术刀自小腿三头肌与跟腱交界处上方4 mm处横断小腿三头肌，紧贴跟骨结节上方横行切断跟腱，立即将带有部分肌肉和完整腱围组织的全长大鼠跟腱投入装有10%中性缓冲福尔马林液（pH=7.2）中常温固定48 h，以备光镜观察和检测使用，取材完成后，颈椎脱臼处死大鼠。

1.6 标本处理

1.6.1 石蜡切片的制作 将标本从固定液中取出，选材，行常规乙醇梯度脱水（70%酒精2h→80%酒精3 h→90%酒精3 h→95%酒精过夜→100%酒精3 h），二甲苯透明30 min 2次，56℃浸蜡包埋3 h，所得蜡块置于4℃冰箱中备用。切片时，使用轮转式切片机4 μm连续切片，将所得石蜡组织片移入45℃的漂烘仪中，待组织片完全展开后，附贴于载玻片上，裱片后移入37℃孵箱中恒温过夜烤片，即可行HE染色。

1.6.2 HE染色 ①石蜡切片脱蜡至水：二甲苯10 min 2次，无水酒精5 min 2次，95%酒精、80%酒精、70%酒精各5 min 1次，自来水洗1 min 1次。②染色：苏木素染液10 min，自来水洗5 min，1%盐酸酒精10 s，自来水洗5 min，弱碱性水溶液（NH3·H2O，1/500）30 s，自来水洗 10 min，蒸馏水洗 1 次，伊红染液10 min，自来水洗5 min，蒸馏水洗2次。③脱水、透明、封片：70%酒精 2 min，80%酒精 2 min，95%酒精 2 min，无水酒精5 min 2次，二甲苯2 min 2次，中性树胶封片。

1.6.3 光镜下组织学观察及细胞计数分析 在640×视野中，对每张切片随机选取5个视野观察并记录造模区域跟腱组织中成纤维细胞、纤维细胞的数量以及细胞总数，取均数后行统计分析。

1.7 实验观察与结果处理

1.7.1 步态检测的数据分析 根据文献[3-4]中所介绍的方法，结合步态检测的原始数据，计算四项步态指标值：步长差比值（TOFF）、足长差比值（PLF）、全趾宽差比值（TSF）和中间趾宽差比值（ITF），并对各项步态指标值分别行统计分析。具体计算方法如下：

TOFF（步长差比值）=（实验侧步长－对照侧步长）/对照侧步长PLF（足长差比值）=（对照侧足长－实验侧足长）/实验侧足长TSF（全趾宽差比值）=（实验侧全趾宽－对照侧全趾宽）/对照侧全趾宽

ITF（中间趾宽差比值）=（实验侧中间趾宽－对照侧中间趾宽）/对照侧中间趾宽

1.7.2 实验标本大体观察 观察大鼠造模侧小腿皮肤愈合情况，有无发红、肿胀等感染表现。观察跟腱与腱围组织的形态、颜色、光泽是否有充血肥厚、有无挛缩、粗大、硬节、跟腱与腱围组织之间有无粘连等。

1.7.3 组织学观察 跟腱细胞数量和形态，有无炎症细胞浸润，腱纤维组织间有无脂肪组织出现，有无软骨钙化，腱围组织中及小血管周围有无血管数量的增加及肥厚，胶原纤维的数量排列以及结构等。

1.8 统计学处理

采用SPSS 11.0统计分析软件处理数据，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，统计方法采用平均值的成对样本分析的t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 步态检测的数据分析

步态检测统计分析结果，各组间步长差比值中，Ⅱ组与Ⅰ组比较，差异有统计学意义（P=0.024＜0.05）；Ⅲ组与Ⅰ组比较，差异无统计学意义（P=0.150＞0.05）；各组间足长差比值中，Ⅱ组与Ⅰ组比较，差异无统计学意义（P=0.080＞0.05），Ⅲ组与Ⅰ组比较，差异无统计学意义（P=0.060＞0.05）；各组间全趾宽差比值中，Ⅱ组与Ⅰ组比较，差异有统计学意义（P=0.015＜0.05），Ⅲ组与Ⅰ组比较，差异有统计学意义（P=0.070＞0.05）；各组间中间趾宽差比值中，Ⅱ组与Ⅰ组比较，差异有统计学意义（P=0.024＜0.05），Ⅲ组与Ⅰ组比较，差异无统计学意义（P=0.150＞0.05）。 见表 1。

表1 各组步长差、足长差、全趾宽差及中间趾宽差比值的比较（ ±s）

表1 各组步长差、足长差、全趾宽差及中间趾宽差比值的比较（ ±s）

Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组组别 只数 步长差比值（TOFF）10 25 25 0.003 0±0.000 4-0.123 0±0.003 9 0.026 0±0.003 1足长差比值（PLF）-0.0310±0.0003 0.020 0±0.003 7 0.007 0±0.004 7全趾宽差比值（TSF）0.054 0±0.004 8-0.1420±0.0039 0.070 0±0.004 7中间趾宽差比值（ITF）0.015 0±0.002 9-0.1630±0.0038 0.016 0±0.002 7

2.2 实验标本大体观察结果

Ⅰ组：正常的跟腱组织连续性好，亮白色，无粗大，无硬节，无软化，无挛缩，腱围组织无充血，无肥厚，跟腱组织与腱围组织间无粘连。Ⅱ组：皮肤切口瘢痕愈合，无红，无波动性肿胀，跟腱连续，颜色暗淡，无光泽，跟腱中段少许增粗，跟腱张力下降，无挛缩，腱围组织半透明，无明显充血、肥厚表现，与跟腱组织无粘连。Ⅲ组：皮肤光滑，无色素沉着及可见瘢痕，跟腱连续性好，亮白色，跟腱较粗，表面无硬结，张力与正常侧相仿，腱围无明显肥厚，与跟腱组织无粘连。

2.3 组织学切片光学显微镜观察结果

光镜下HE染色标本组织学观察显示，各组均无炎症细胞浸润，无腱细胞脂肪化、透明样变、黏液样退变、纤维变、腱纤维组织间无脂肪组织出现，无软骨样化生或钙质沉着。具体观察结果见图1～3。

Ⅰ组正常跟腱组织（图1）：细胞少，胶原纤维多，细胞以成熟的纤维细胞为主，细胞核细长，呈嗜碱性染色，个别细胞核为圆形，为成纤维细胞，胶原纤维呈束状，嗜酸性染色，排列规则，腱组织内毛细血管很少，腱围组织中有脂肪细胞、纤维细胞和成纤维细胞以及毛细血管。Ⅱ组（图2）：成纤维细胞多，纤维细胞少，胶原纤维排列紊乱，部分与成纤维细胞一起呈簇状排列，血管较多，血管周围无炎症细胞，部分肌肉细胞核内嵌，腱周围血管无肥厚。Ⅲ组（图3）：细胞多，排列密集，以成纤维细胞为主，分布均匀，胶原排列整齐，无断裂，腱组织内毛细血管较少，而腱周围内有丰富的血管，细胞丰富，多为成纤维细胞。

2.4 各组中成纤维细胞数比较

对造模区域跟腱组织细胞（主要是成纤维细胞）进行显微镜下计数，并行统计检验，结果如下：Ⅲ组与Ⅱ组的成纤维细胞数明显多于Ⅰ组，Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组相比，差异均有统计学意义（P=0.003＜0.01、P=0.028＜0.05），见表 2。

3 讨论

3.l 大鼠跟腱病模型的相关探讨

本实验采用直视下向大鼠跟腱内注射1%的大鼠Ⅰ型胶原酶的方法，通过胶原酶对胶原纤维的降解作用从而建立跟腱病的动物模型。大体病理学观察发现，造模部分跟腱（跟腱中段）增粗，颜色变暗，张力减低，跟腱表面不平整，局部出现小结节；光镜下组织学观察发现，跟腱胶原纤维排列不规整，甚至断裂，而且无炎症细胞表达，自始至终无明显改变；功能检测发现，该造模方法还严重影响了大鼠的步态，整个实验过程中，TOFF、TSF、PLF、ITF 皆为负值，且每期各步态指标之间均无差异。在研究该病的病理方面，大多数研究表明慢性跟腱损伤是退行性改变而无炎性成分，因此更多的学者使用“腱病”这一诊断[5]，由此可见，以上结果与人体跟腱病的临床表现及病理检查所见完全一致，而且并无炎症证据，说明该造模方法较好地模拟了人类跟腱病，可用于跟腱病治疗的实验研究。

3.2 步态检测功能评价的方法和依据

步态检测能够综合而直接地反映出患跟腱病大鼠的踩关节功能情况。TOFF、PLF、TSF、ITF这些步态指标生动地显示出大鼠跛行程度，当大鼠肢体承受了比较少的重量时，除PLF外其余三项指标都会变小，因此实验侧数值减去健侧数值后所得比值必定为负值。由于当大鼠肢体病残时其将足平放于地面以休息下肢，所以此时PLF值是增大的，所以健侧数值减去实验侧数值后计算所得比值与其他指标同为负值。本检测方法使用了比值这一方法，通过健侧与患侧的比较，体现出功能评价的合理性。

3.3 组织学细胞计数的比较分析

跟腱细胞是一种特殊形式的成纤维细胞（fibroblast），其中功能休止时的成纤维细胞又被称为纤维细胞（fibrocyte）。成纤维细胞是合成胶原的主要细胞，成纤维细胞合成与分泌胶原能力的增强或成纤维细胞的大量增殖，都可以导致胶原总量的增加。跟腱修复的特征之一是成纤维细胞的增生，在该过程中，休止的纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，从而积极合成和分泌细胞外成分，形成结缔组织的纤维和基质。本实验发现，各治疗组成纤维细胞数均多于对照组，亦即处于激活状态的纤维细胞较对照组明显为多，从而表现出各治疗组跟腱细胞相对旺盛的增殖能力和合成胶原状态。

3.4 穴位注射复方丹参注射液的探讨

穴位注射治疗法是集多种方法（针刺、药物、经络）效应于一体的复合性治疗方法，其机制为多种刺激同时发挥作用以改善机体微循环，增强人体的免疫力，达到治疗目的[6]，穴位注射又名水针、穴位封闭，是指根据中医辨证施治理论，采用小剂量中药或西药注入穴内以治疗疾病的一种方法。穴位注射将中西医两方面因素结合起来，兼具中医针灸与西医注射的特点，是针灸、穴位、经络和药物的有机结合体。该疗法以其简便的操作和显著而快捷的临床疗效而成为祖国传统针灸治疗方法有效的补充。

本实验选取了阳陵泉、昆仑、承山三个穴位，行穴位注射复方丹参注射液治疗大鼠跟腱病，实验发现，丹参在4 μmo1/L浓度条件下对能化后的跨膜电位变化有一定的恢复作用，从而减轻O2-对线粒体的损伤作用[7]，而本实验Ⅲ组的成纤维细胞数、细胞总数均明显大于阳性对照组，可能与穴位注射复方丹参注射液改善跟腱病腱组织的血供和功能状况有关，有研究表明，丹参能促进组织的修复与再生[8]。因此无论从运动功能恢复情况观察，还是从大体病理改变、组织学细胞计数、胶原纤维的重新排列等方面的统计结果看，都取得了显著的效果，分析原因可能与以下因素有关：药物注射入穴位后，因其本身占据一定空间，故可产生压力从而刺激腧穴局部，并通过经络系统而发挥扶正祛邪、疏调气血、平衡阴阳等作用。现代研究发现，这种刺激可通过神经系统，反射性地干预神经-免疫-内分泌系统，从而起到防病治病的作用；同时在药动力学方面，有学者认为穴位注射给药可使药物沿经络到达病所，加速了药物吸收的进程，减少了药物作用过程中不必要的“消耗”，现代研究己初步证实了这一观点，并且实验表明穴注给药的药物潜伏期与静脉注射给药相同，而明显快于肌内注射和皮下注射，故其穴位注药吸收迅速完全，为取得确切、可靠的疗效奠定了基础，同时丹参作为活血化瘀类药物，具有活血化瘀、行血止痛、去瘀生新之功效[9]，现代药理学研究显示，丹参有减轻组织水肿、炎症、变性坏死，减轻线粒体损伤，加快病灶清除，促进损伤细胞的修复等作用[10-12]。因此，其在跟腱病的恢复方面也起到了重要的治疗作用。

4 结论

穴位注射复方丹参能有效改善跟腱病大鼠步态，根据多项指标统计比较并结合形态学观察，应用复方丹参注射液对改善跟腱病理学变化、阻止跟腱病的恶化过程，降低军事训练伤的发生和非战斗性减员有简便易行防病治病的作用。

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