接尘工人血清中抗核因子、人抗中性粒细胞浆抗体水平的检测

王明君，孙雁玲，汪涵，姚武，郝长付

(1.中国平煤神马能源化工集团有限责任公司医疗集团 河南 平顶山 467000;2.郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室 河南 郑州 450001)

尘肺病是目前中国职业病中最严重的一类，但迄今为止，国内外已经对尘肺病进行了大量的相关研究，但尘肺病的形成机制目前还不十分清楚，另外，在尘肺病的早期预防、早期诊断以及接尘人群监测等方面也依然缺乏有效的检测指标，因此，积极预防并尽早诊断对于增进病人生存质量及延长寿命尤为重要［1］。Otsuki［2］等认为矽肺的发生与免疫系统的调节变化密切相关，Wu等［3］认为尘肺病的发生之前可能出现CD4+CD25+调节的T细胞减少。总之，在尘肺发病过程中，尘肺患者机体免疫功能异常已属无疑，但还有些问题尚未得到解答，为了探讨自身免疫抗体在尘肺病发生、发展中的意义，进一步筛选尘肺病相关生物标志物，本研究以接尘工人为研究对象，采用ELISA法检测研究对象血清中抗核因子(ANA)、人抗中性粒细胞浆抗体(cANCA)的表达水平，探讨其变化水平与粉尘暴露之间的可能关联。

1 对象和方法

1.1 研究对象 接尘组:河南省某煤业集团119例男性煤矿工人，年龄21～59岁，平均年龄为:(38.61±8.99)岁;接尘年限1～36年，平均年限为(17.74±9.92)年。对照组:郑州大学第一附属医院男性健康体检者84例，无粉尘接触职业史，均排除心、脑、肝、肾等脏器的纤维化性疾病以及免疫疾病，年龄25～53岁，平均年龄为(45.50±9.55)岁。研究对象均知情同意。

1.2 样品采集 全部研究对象取清晨空腹静脉血3 ml，静置 30min后，离心分离血清(3 000r/min，10min)，置－20℃保存待用。

1.3 自身免疫抗体的检测 采用双位点夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血清自身免疫抗体ANA、cANCA的含量，自身免疫抗体试剂盒由安迪生物科技(上海)有限公司生产，操作均严格按照说明书进行，质量控制和定标结果均在要求范围内。

①分别设空白孔、标准样品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl;在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。每空加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动摇匀，37℃温育60min。

②弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，震荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，如此重复5次，拍干。

③每孔加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡均匀，37℃避光显色1 min。

④取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应。

⑤测定:以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值。测定应在加终止液后15 min内进行。

⑥根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。由于样品经过稀释，所以其实际浓度应再乘以总稀释倍数。

⑦根据试剂盒说明书自身免疫抗体阳性判断的阈值为 ANA 562.5 ng/L、cANCA 375 ng/ml。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行统计学处理，计数数据以()表示，进行t检验和单因素方差分析，计量数据以四格表形式表示，进行χ2检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 接尘组与对照组血清中自身免疫抗体 ANA、cANCA含量和阳性率的比较 由表1可见，接尘组血清中自身免疫抗体ANA、cANCA的表达水平均高于接尘组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。由表2可见，接尘组血清中自身免疫抗体ANA、cANCA表达的阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 接尘组与对照组血清自身免疫抗体ANA、cANCA含量()

表1 接尘组与对照组血清自身免疫抗体ANA、cANCA含量()

注:*方差齐性检验P＜0.05，方差不齐;#方差齐性检验P＞0.05，方差齐。

组别 n ANA(ng/L) cANCA(ng/L)接尘组0.001 0.001 119 401.79 ±96.11 356.68 ±123.16对照组 84 268.85 ±85.61 174.77 ±85.22 t 11.700# 18.445*P

表2 接尘组与对照组血清自身免疫抗体ANA、cANCA阳性率的比较

2.2 接尘组血清中自身免疫抗体含量与年龄的相关性分析 由表3可见，自身免疫抗体ANA、cANCA在接尘组中各年龄组间的含量差异无统计学意义(P＞0.05)，进一步进行相关分析(见表4)，接尘组自身免疫抗体 ANA、cANCA含量与年龄无相关性(P＞0.05)。

表3 接尘组不同年龄工人血清自身免疫抗体含量()

表3 接尘组不同年龄工人血清自身免疫抗体含量()

年龄(岁) n ANA(ng/L) cANCA(ng/ml)＜41 61 405.07 ±12.41 348.19 ±13.9041～ 58 398.34 ±12.60 365.61 ±18.03 t 0.723 0.770P 0.471 0.443

表4 接尘组工人血清中自身免疫抗体ANA、cANCA含量与年龄的相关性

2.3 接尘组血清中自身免疫抗体含量与工龄的相关性分析 由表5可见，自身免疫抗体ANA、cANCA在接尘组不同接尘工龄层间血清含量的差异无统计学意义(P＞0.05)。由表6可见，自身免疫抗体ANA、cANCA在接尘组血清中的含量与工龄无相关性(P＞0.05)。

表5 接尘组不同接尘工龄血清中自身免疫抗体含量()

表5 接尘组不同接尘工龄血清中自身免疫抗体含量()

接尘工龄(y) n ANA(ng/L) cANCA(ng/ml)＜11 40 386.48 ±115.55 350.28 ±110.9011～ 22 399.81 ±65.63 361.63 ±107.53 21～ 57 416.40±90.14 359.26 ±137.90F 1.202 0.083 P 0.304 0.920

表6 自身免疫抗体ANA、cANCA在接尘组血清中的含量与工龄的相关性

3 讨论

尘肺是一种肺纤维化疾病，它的发生发展与机体自身内外因素密切相关，纤维化实质上是机体对肺损伤的一种修复机制，与多种纤维化有关的自身免疫抗体密切相关，它们的表达反映了受损害程度的大小，预示了疾病发展的结局，在早期的异常表达亦可做为判断预防控制疾病的预警信息。尘肺患者出现自身抗体，其机理可能与巨噬细胞的吞噬活动有关，煤尘细胞的毒作用使巨噬细胞吞噬煤尘后变性、坏死、崩解，巨噬细胞的自身崩解，使细胞核内多种抗体成分暴漏，产生自身免疫抗体，自身抗体含量的升高可反映机体免疫应答的失调。煤矿工人尘肺和进行性大块肺纤维化的血清学变化显示尘肺患者的自身免疫抗体水平比正常人高的多，本次研究的目的就在于探讨自身免疫抗体ANA、cANCA在尘肺病早期变化中表达水平的变化及其意义，探讨其做为肺纤维化早期诊断指标的可能性。

cANCA是一组以中性粒细胞浆成分为抗原的自身抗体，已证明对很多疾病有诊断价值，并认为有致病作用。cANCA的主要靶抗原存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，不同的抗原各有不同的生化功能，往往与临床上不同的疾病有关［4］。ANA包含一组自身抗体，无种属和器官特异性，见于多种疾病，缺乏特异性。在自身免疫性疾病中，细胞核常成为自身免疫反应的靶子。ANA主要是指对核内成分所产生的抗体，此外也包括对核内成分相同的物质所产生的抗体［5，6］。

本研究结果表明接尘工人血清ANA、cANCA含量高于对照组，同时接尘组表达水平的阳性率也高于对照组。研究结果表明，这2种与免疫性疾病有关的抗体分子可能与粉尘暴露之间存在一定的关系，有成为粉尘暴露生物监测指标的可能性，但其具体机制尚不明确，仍需进行进一步的研究。但其与年龄和接尘工龄之间未发现相关性，即与粉尘暴露量之间的关系尚不能明确，这需要在以后的研究中收集详细的粉尘暴露资料来阐明。

总之，接尘工人体内存在自身免疫抗体水平的变化，可以进一步证明尘肺病患者机体存在免疫功能的异常变化。因此，自身免疫抗体指标有成为粉尘暴露监测，甚至做为早期筛查高危人群生物学指标的可能性，值得进行深入的研究。这对于提高接尘工人及尘肺病患者健康监护、生物监测和早期预警水平，提高预防控制效果，具有一定的的实际意义。

［1］金泰廙，孙贵范.职业卫生与职业医学.第6版.北京:人民卫生出版社，2008.182-184.

［2］Otsuki T，Maeda M，Murakami S，et al.Immunological effects of silica and asbestos［J］.Cell Mol Immunol，2007，4(4):261-268.

［3］Wu P，Miura Y，Hyodoh F，et al.Reduced function of CD4+CD25+regulatory T cell fractions in silicosis patients［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2006，19(2):357-368.

［4］李莉，吴若芬.抗中性粒细胞胞浆抗体的检测及意义［J］.宁夏医学杂志，2006，28(6):205-207.

［5］刘胜勇，张冬平，李学军.抗平滑肌抗体、抗核抗体与慢性乙肝肝纤维化程度相关性研究［J］.中国现代医生，2008，46(3):450-453.

［6］王自正.现代医学标记免疫学［M］.北京:人民军医出版社，2000.127-128，277-284.