腊梅叶挥发性成分及其抑菌活性研究

2011-01-26刘祝祥贺建武彭德娇石进校

湖南农业科学 2011年1期

刘祝祥，贺建武，彭德娇，向芬，石进校

（吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000）

腊梅（Chimonanthus praecox）隶属腊梅科（Calycanthaceae），为第四纪冰川孑遗植物[1]，是我国特有的传统名花和经济树种，秦岭以南和横断山脉以东为其现代分布中心[2]。腊梅花、叶、茎、根均能入药，具有解暑生津，镇咳止痰的功效[3]。刁军成等[4]对腊梅的同属植物山腊梅叶进行了抑菌研究，发现其温热蒸发物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，并且水提取液能直接抑制流感病毒。朱华年等[5]研究发现腊梅叶的甲醇提取物具有一定的清除自由基活性。目前，对腊梅叶挥发性成分及其抑菌活性等方面的研究未见文献报道，为综合开发利用腊梅资源，本文采用超临界CO2流体萃取技术萃取腊梅叶挥发性成分，结合GC-MS联用技术对挥发性成分进行分离和鉴定，并对其抑菌活性进行了研究，以期为腊梅的利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品野生腊梅叶采于吉首德夯，腊梅由吉首大学生物资源与环境科学学院陈功锡教授鉴定为腊梅科腊梅属腊梅。采集好的腊梅叶经45℃低温烘干，碾碎备用。

1.1.2 仪器与试剂华安HA121-50-1型超临界流体萃取装置（江苏南通华安超临界流体萃取有限公司）；气质联用器：GCMS-QP2010（日本岛津，配NIST2005标准质谱库）。所用试剂均为国产分析纯。

1.1.3 抑菌指示菌与培养基用于抑菌实验的8个敏感指示菌为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）、黑曲霉（Asperillus niger）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、白色念珠球菌（Candida albicans），由吉首大学微生物资源与生态实验室保藏。培养基为营养琼脂培养基。

1.2 方法

1.2.1 挥发性成分超临界CO2流体萃取称取腊梅叶干粉500 g装入料筒，放进萃取釜，按工艺要求开启萃取装置，调节萃取温度为35℃、萃取压力25 Mpa、CO2流量 15 L/min，待制冷系统、萃取温度和CO2流量稳定后，开动高压泵进行循环萃取。从钢瓶出来的CO2经过滤系统和制冷系统后，经高压泵达所需压力，由预热系统升至所需温度后，与原料接触，被萃取成分溶解在CO2中，萃取物流入分离系统，萃取时间为3 h，改变压力，降低萃取物在超临界CO2中的溶解度而析出，萃取物用收集瓶接收，CO2气体经系统循环利用。

1.2.2 挥发性成分GC-MS分析色谱柱为RTX-5MS弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：柱起始温度60℃，保持1 min，以10℃/min的速率升至160℃，保持4 min，再以5℃/min的速率升至260℃，保持5 min；进样口温度250℃；载气（氦气）流量为 1 mL/min；进样量 0.5 μL，分流比为 1:30。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度：200℃，接口温度230℃，扫描范围29～450 amu。

1.2.3 抗菌活性的测定[6]采用滤纸片琼脂扩散法测定腊梅叶挥发性成分的抗菌活性，取八种指示菌分别接种于培养基中，混合倒平板，待培养基凝固，在超净工作台上分别取两片蘸有腊梅叶挥发性成分的小纸片贴在含有指示菌的培养基表面。置于恒温培养箱中，28℃培养48 h后观察抑菌圈大小。重复3次。

2 结果与分析

2.1 超临界CO2流体萃取结果

按照上述萃取条件，经过3 h萃取，共得到约3 mL油状物。

2.2 GC-MS分析结果

用GC-MS技术对腊梅叶挥发性成分进行分离和鉴定，总离子流图见图1。对总离子流图中的各峰经积分，按峰面积归一化法确定各组分相对含量，并结合NIST2005标准质谱库，对各峰进行鉴定，结果见表1。

图1 腊梅叶挥发性成分GC-MS总离子流图

由表1可知，通过GC-MS技术分离和鉴定，腊梅叶挥发性成分中共鉴定出25种化学成分，占挥发性成分相对含量的98.47%，主要为稠环芳烃、烷烃、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸。其中醇相对含量占37.75%、烷烃相对含量占28.58%、烯烃相对含量占11.15%、稠环芳烃萘占10.23%、酯相对含量占4.31%，酚相对含量占2.84%，还含有少量的脂肪酸。

2.3 活性测定结果

以滤纸片琼脂扩散法测定腊梅叶超临界CO2萃取物的挥发性成分的抗菌活性，结果表明挥发性成分对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌均有抑菌现象（表2），其中对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最佳。

3 小结与讨论

利用超临界CO2流体萃取技术，部分脂溶性化合物在CO2笼罩下进行提取，可以有效地防止热敏及光敏性物质的氧化和逸散[7]，比常规的水蒸气蒸馏法能更好地萃取腊梅叶的挥发性化学成分。通过GC-MS联用技术分离鉴定出腊梅叶挥发性化学成分，主要有稠环芳烃、烷烃、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸物质。腊梅叶挥发性化学成分中环扁桃酯是一种能改善血流变及血栓形成的有效化合物[8]；2,4-二叔丁基苯酚是制备抗氧化剂的重要中间体[9]；叶绿醇能有效降低血清总胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇的含量[10]；β-波旁烯我们曾在研究腊梅籽化学成分中也有报道；β-榄香烯体内外均有显著的抗肿瘤作用，可有效诱导肿瘤细胞凋亡；邻苯二甲酸酯有抗氧化、抗癌、抗菌及驱虫避蚊等活性。抑菌结果表明，腊梅叶挥发性成分抗菌谱广，对金黄色葡萄球菌的抗菌效果明显，从中鉴定出来的重要化合物，具有抗菌、抗癌等生物活性。腊梅叶作为传统消炎杀菌药物，可能与这些抑菌成分有关。上述结果表明，腊梅叶具有较重要的价值，值得进一步研究以促进其在医药和农业上的利用。