基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

李 爽李尧华* 叶懿文李 昕于 顺杨 慧陈 彪

(1.首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学研究室，教育部神经变性病重点实验室，北京100053;2.首都医科大学北京神经科学研究所，北京市神经再生修复研究重点实验室，教育部神经变性病重点实验室，北京100069)

含L(DLR类)A重复分拣蛋白相关受体〔sortilinrelated receptor，L(DLR class)A repeats-containing，SORL1〕是一种Ⅰ型跨膜蛋白，相对分子质量约为250000。在脑内，SORL1大量存在于海马、齿状回和大脑皮质的神经细胞内［1］。研究［2］显示SORL1与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的加工、处理过程相关，如抑制SORL1的活性，神经元内就会产生更多数量的β淀粉样蛋白。另外，sorl1基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)相关，特别是在散发性AD患者的脑脊液中发现SORL1蛋白表达水平明显下降［3-4］。因此，普遍认为SORL1是继载脂蛋白E ε4(apolipoprotein E epsilon 4，APOE ε4)之后发现的与散发性AD关系较为密切的风险因子之一［5］。本实验将人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段亚克隆至原核表达载体，研究了sorl1 cDNA片段在原核细胞中的表达过程，制备了高纯度基因重组人SORL1蛋白质片段，为制备抗SORL1抗体提供样品保障。

1 材料和方法

1.1 材料

质粒pET-28a(+)为本实验室保存;限制性核酸内切酶NcoⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit购自大连宝生物工程有限公司;Gel Extracton Kit购自美国Omega公司;质粒小提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;蛋白定量试剂盒(BCA protein assay Kit)购自美国Pierce公司;感受态细菌DH 5α和BL21(DE3)plysS购自北京鼎国生物公司。人sorl1 cDNA由美国加利福尼亚大学马秋兰教授惠赠。

1.2 引物设计及PCR扩增

参照Genebank中NM003105.4的mRNA序列设计上游引物序列为：5'-CGCCATGGTGGTCATCAAGTGGGAAT-3'，下游引物序列为：5'-CGCGTCGACTCACTCATAGCCCCTGCTT-3'。在两引物中分别导入NcoⅠ和SalⅠ限制性核酸内切酶位点序列。以人sorl1 cDNA为模板，按照如下程序扩增目的DNA：95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，循环数为30。

1.3 重组表达质粒的构建

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收其358 bp片段。把纯化后的DNA片段和pET-28a(+)空载质粒分别经内切酶NcoⅠ和SalⅠ消化。将酶切后的PCR产物与线性pET-28a(+)回收，用DNA Ligation Kit在16℃下连接30 min，转化至DH 5α感受态细菌中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基中，次日挑取单一菌落进行小培养，提取质粒并测序。

1.4 重组质粒的原核细胞表达

将重组质粒转化至BL21(DE3)plysS感受态细菌，挑取单一菌落，接种至10 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，230 r/min振荡16 h。取2.5 mL培养液接种至250 mL含有卡那霉素(1∶1 000)的2× YTA培养基，37℃振荡培养3 h后，加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropyl beta-D-thiogalactopy ranoside，IPTG)诱导转化菌4 h。离心收集细菌沉淀，用预冷的Tris-HCl(20 mmol/L)-EDTA(1 mmol/L)悬浮，超声破碎(工作2 s，间隔2 s，10 min)，离心(4℃，10 000 g，30 min)后SDS-PAGE分析。

1.5 包涵体的洗涤与溶解

包涵体组分分别用缓冲液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)、Ⅱ(缓冲液Ⅰ+1%Triton-X 100)和Ⅲ(缓冲液Ⅰ+2 mol/L尿素)4℃下洗涤30 min，离心(4℃，10 000 g，30 min)弃上清。加入缓冲液Ⅳ(缓冲液Ⅰ+8 mol/L尿素)，冰浴搅拌1 h，离心收集上清。

1.6 重组蛋白的纯化

将溶解的包涵体组分应用 TSK-GEL G3000 SWXL色谱柱分离。流动相：50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0。回收目标蛋白质组分，用PBS透析过夜。蛋白定量采用BCA法，以牛血清白蛋白为标准。

2 结果

2.1 人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段的扩增

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离可见约358 bp大小。纯化和回收扩增产物并与pET-28a(+)连接。对重组质粒测序结果证明，亚克隆的cDNA全长 358 bp，编码 113个氨基酸，与 Genebank中NM003105.4的mRNA的5 923～6 260 bp区完全相同(图1)。

图1 人sorl1 cDNA片段核苷酸序列及编码氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the human sorl1 cDNA fragmentsorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.2 重组质粒的原核表达

重组质粒在BL21(DE3)plysS细菌中的表达量随IPTG诱导的时间递增，且存在于细菌的包涵体组分中(图2)。

图2 重组质粒在原核细胞中的表达Fig.2 Prokaryotic expression of PET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bpEach sample(5 μL)was separated with SDS-PAGE and stained by coomassie brilliant blue R250.Lane 0～4：bacterial lysate，induced-time(0～4 h)with IPTG;Lane 5：the soluble fraction of bacterial lysate;Lane 6：the insoluble fraction of bacterial lysate(inclusion bodies fraction);Lane7：inclusion bodies dissolved in 8mol/L urea;Lane 8：the purified recombinant protein by column chromatography;M：protein standard molecular weight marker;sorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.3 重组蛋白的纯化

经8 mol/L尿素处理后的重组蛋白通过TSKGEL G3000 SWXL色谱柱的保留时间为18 min(图3);纯化的目的蛋白在SDS－PAGE上表现为单一条带(图2)。每500 mL细菌培养液可获得重组蛋白约为24 mg。

图3 重组蛋白的纯化Fig.3 Purification of the recombinant proteinArrow：the peak of target protein separated by TSK-GEL G3000 SWXL column chromatography.

3 讨论

SROL1是一个多区域蛋白，且与低密度脂蛋白受体同源，具有物质运输、分子伴侣、信号转导以及蛋白分选等多种生物学功能。虽然受到遗传异质性的影响，但是包括中国汉族人群在内的多种族、多中心遗传学研究［6-8］支持sorl1基因多态性与AD密切相关。APP的蛋白水解过程一直被认为是AD发病中心环节［9］。位于反面高尔基体网(trans-Golgi-network，TGN)的SORL1与调节蛋白共同作用调控APP的靶向运输，阻止其进入β淀粉样蛋白(amyloid protein β，Aβ)生成途径［10］。过表达的SORL1可以引起APP重新分布到高尔基体，减少Aβ的产生，而在基因敲除小鼠模型中，APP的水解代谢增加、Aβ异常积聚，促进老年斑的形成［11-12］。另外，SORL1富含于脑内神经元，研究［13-14］显示在散发性AD患者中，其神经细胞内的SORL1蛋白含量明显减少，且与AD病理易损区(如海马、颞叶大脑皮质)的淀粉数斑块数量呈负相关。最重要的是，在伴有轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)的症状前 AD患者中同样也发现SORL1蛋白水平已有下降，表明SORL1的病理性改变是散发性AD的早期事件，同时也是Aβ产生的始动因素［15-16］。因此，监测体内SORL1蛋白含量可能成为一种新的早期诊断散发性AD的生物标记物。

sorl1基因位于11q23.2-24.2，其cDNA包含一个6 639 bp的开放阅读框，编码2 214个氨基酸。本研究采用了基因工程技术重组了人sorl1基因片段，选用的载体是 pET-28a(+)原核表达载体。依据人sorl1 cDNA编码氨基酸的亲、疏水性先后选择了3个亲水性较强的候选片段，利用载体中NcoⅠ酶切位点中的起始密码ATG序列设计引物。3个重组质粒测序证实阅读框无误后，SDS-PAGE结果显示其中两个重组质粒在大肠杆菌不表达(结果未展示)，只有pET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp在IPTG的诱导下，一个分子量约13 000的蛋白质开始表达并呈现时间依赖性递增，而且表达的目标蛋白以包涵体的形式存在于细菌沉淀中。本课题组应用8 mol/L尿素溶解包涵体，并将其进行凝胶过滤层析、透析复性等处理，最后通过SDS-PAGE电泳鉴定，证实目的蛋白纯化成功，为制备抗SORL1抗体并探讨AD的发病机制奠定了基础。

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