小白菜和菜薹细胞质雄性不育类型的分子鉴定

周国林，林处发，胡侦华，丁毅，邓耀华，汪爱华

（1.武汉市蔬菜科学研究所，430065；2.武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室/武汉大学生命科学学院）

小白菜和菜薹细胞质雄性不育类型的分子鉴定

周国林1，林处发1，胡侦华1，丁毅2，邓耀华1，汪爱华1

（1.武汉市蔬菜科学研究所，430065；2.武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室/武汉大学生命科学学院）

通过检索NCBI核苷酸数据库获得orf 138和orf 224开放阅读框序列，依据其保守序列设计2对引物，对几种来源不同的小白菜和菜薹细胞质不育系及其保持系进行PCR扩增。orf 138引物在小白菜和菜薹细胞质雄性不育系中均扩增出573 bp的片段，orf 224引物只在一个菜薹雄性不育系中扩增出653 bp的片段。同源性比对发现orf 138引物在雄性不育系中扩增的片断与orf 138基因同源度达100%，表明这几个雄性不育系类型分别为萝卜细胞质不育类型；orf 224引物在雄性不育系中扩增的片断与orf 224基因同源度达100%，表明这一雄性不育系类型为甘蓝型油菜不育类型。

小白菜；菜薹；细胞质雄性不育

在十字花科作物的优势育种中，除利用自交不亲和系以外，利用雄性不育系也是一条重要的途径。利用雄性不育可以省去人工去雄过程，因此在农作物杂种优势利用上有重要应用价值。细胞质雄性不育 （CMS）是由线粒体基因组的重排引起的，CMS相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能，从而导致花粉败育[1]。在芸薹属作物中已鉴定和分离出一些与CMS有关的线粒体基因，如Ogu型萝卜的orf 138[2]、Pol型甘蓝型油菜的orf 224、Nap型甘蓝型油菜的orf 222[3]以及叶用芥菜的orf 220[4]等，而研究最多、利用最广泛的是Ogu CMS和Pol CMS[5]。

试验利用油菜线粒体CMS基因特异性引物及基于重复序列的PCR引物对几种来源不同的小白菜和菜薹细胞质雄性不育材料和保持系材料进行分析和鉴定，以建立有效的小白菜和菜薹细胞质雄性不育的分子鉴定方法，为杂交品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小白菜不育系材料8份，保持系材料3份；菜薹不育系材料2份，保持系材料1份，具体见表1。

1.2 试验方法

①基因组的提取和引物设计 基因组DNA的提取参照CTAB法[6]。根据油菜线粒体中的orf 138和orf 224开放阅读框保守区序列设计2对引物，引物交由金瑞斯生物科技公司合成，引物序列见表2。

②PCR扩增 PCR扩增反应在PX2 ThermalCycler（Thermo Hybaid）PCR仪上进行，反应体系为：DNA 模板 6 ng，10×buffer 2.5 μL（含 MgCl2），1.5 mmol/L dNTP，0.4 U Tag DNA聚合酶（MBI），0.6 μL引物（25 pmol/μL），加水至25 μL。PCR扩增反应程序为：94℃30 s，50℃45 s，72℃2 min，共35个循环，最后一个循环结束后再在72℃继续延伸10 min于4℃保存。PCR产物在1.5%琼脂糖（西班牙产）凝胶上电泳分离（5 V/cm），电泳结束后在紫外灯下观察照相。

表1 供试的小白菜、菜薹细胞质不育系和保持系材料

表2 基于orf 138和orf 224基因设计的引物

③PCR特异条带的连接转化克隆和测序 连接体系为5 μL，0.5 μL pGEM-T载体，0.5 μL Ligase，2.5 μL 2×Ligase，1.5 μL PCR产物，然后16℃连接过夜，再转化TOP10感受态细胞，进行菌液PCR，利用菌液PCR测序分析。

④序列分析 将特异DNA片段的核苷酸序列在 NCBI网上应用 BLAST命令（http://www.ncbi. nlm.nih.Gov/blast）进行氨基酸序列同源性比对。

图1 a.orf 138引物PCR扩增产物电泳图谱；b.orf 224引物PCR扩增产物电泳图谱

2 结果与分析

2.1 orf 138和orf 224引物的扩增结果

用设计的orf 138引物和orf 224引物对12份小白菜和3份菜薹材料的DNA进行扩增。用orf 138设计的引物在不同材料间进行PCR扩增，扩增结果表明不同材料间存在差异，在小白菜材料紫红A、WS-1、WS-2、WS-3、WSX-4、WSX-5、苏A07A、奶A和菜薹HA1不育系中扩增出600 bp左右的条带，大小相同（图1a）；而保持系材料间均没有扩增出条带。用orf 224特异引物进行不同材料的PCR扩增，只在红菜薹材料HA1中扩增出650 bp左右的条带，其他不育材料及保持系材料间均没有扩增出差异条带（图1b）。

图2 小白菜CMS与Ogu CMS萝卜orf 138核苷酸序列同源性比较

图3 红菜薹CMS与Pol CMS萝卜orf 224核苷酸序列同源性比较

2.2 测序和同源性比较

分别选取在orf 138引物和orf 224引物扩增出条带的供试材料阳性克隆进行测序。利用NCBI在线Blast功能对测序结果进行分析，结果表明利用orf 138的保守序列设计的引物扩增出的片段的核苷酸序列一致性达到100%，长度均为573 bp，该片段与Ogu型胞质不育萝卜线粒体开放读码框orf 138同源性为100%（图2），说明几个来源不同的小白菜和菜薹胞质雄性不育材料同属于萝卜细胞质不育类型；同样利用orf 224的保守序列设计的引物扩增出的片段的核苷酸的长度为653 bp，该片段与Pol型胞质不育甘蓝型油菜线粒体开放读码框orf 224同源性为100%（图3），说明这个菜薹材料HA1的不育类型属于甘蓝型油菜细胞质不育。

3 小结与讨论

十字花科包含许多重要的经济类作物，如大白菜、不结球白菜、甘蓝、萝卜、菜薹、甘蓝型油菜等。优势育种是十字花科作物品种改良的重要途径。在十字花科作物的优势育种中，利用雄性不育系是一条重要的途径。研究最多、利用最广泛的主要有转育的萝卜Ogu CMS、甘蓝型油菜Pol CMS。Ogu CMS是小仓于1968年在日本鹿儿岛一个萝卜品种留种田中发现的雄性不育个体（表现花蕾小，花柱弯曲，雄蕊正常），后经选育而成不育系，对Ogu型胞质不育萝卜的大量研究证明，orf 138开放阅读框的确可引起Ogu型胞质不育[2]，Ogu胞质雄性不育系是迄今发现的不育源中不育性表现最为稳定的类型，已经被转育到十字花科的其他作物中，如不结球白菜、甘蓝等。Pol CMS是从甘蓝型油菜品种Polma群体中发现的不育株经选育得到的，orf 224开放阅读框的确可引起Pol型胞质不育。国际上认为Pol CMS是当今世界上最有生产价值的胞质雄性不育系，不仅在油菜雄性不育系的选育中被广泛利用，而且在其他十字花科作物雄性不育系的选育中也被广泛应用[7～9]。

本研究利用同源序列的候选基因法快速鉴定了小白菜和菜薹的细胞质雄性不育系和保持系，明晰了供试小白菜和菜薹的细胞质雄性不育类型，为今后更好地开展细胞质雄性不育系在育种中的应用奠定了基础，为实现优势育种提供了分子依据。小白菜是异花授粉作物，杂种优势非常明显，优良组合比常规品种一般增产30%左右。但是研究也发现小白菜细胞质雄性不育系来源单一，因此要继续收集不同类型的细胞质雄性不育类型、进行属间不同胞质雄性不育型之间的转育，发现或者创造新型胞质雄性不育型，以实现育种的丰富性和多样性。

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[4]杨景华，张明方，喻景权，等.叶用芥菜细胞质雄性不育相关基因orf 220的分子特性 [J].遗传学报，2005，32（6）：594-599.

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[9]戴忠良，秦文斌，姚悦梅，等.甘蓝胞质雄性不育系的选育[J].江苏农业学报，2008，24（5）：731-732.

Molecular Identification of Cytoplasmic Male Sterile Types Non-heading Chinese Cabbage and Chinese Flowering Cabbage

ZHOU Guolin1,LIN Chufa1,HU Zhenhua1,DING Yi2,DENG Yaohua1,WANG Aihua1
(1.Wuhan Vegetable Science Research Institute,430065; 2.College of Life Science/Key Laboratory of Plant Developmental Biology,Ministry of Education,Wuhan University)

In order to identify the cytoplasmic male sterile (CMS)types in non-heading Chinese cabbage(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino)and Chinese flowering cabbage (B.campestrisL.var.purpureaBaileysh),two pairs primers were designed based on the conserved domains of the sequences of orf 138 and orf 224 genes were got by searching the nucleotide databases of NCBI.The result indicated that a 573 bp specific fragment was produced in all the CMS lines by amplification with the orf 138 primer.The sequence alignment showed that the specific fragment of 573 bp from the CMS lines and the Ogu orf 138 of Ogu CMS in radish reached 100%in homology.Also the specific fragment of 653 bp from the Chinese flowering cabbage CMS line achieved 100%in homology with the Pol orf 224 of Pol CMS in rapeseed (B.napusL.).

Non-heading Chinese cabbage;Chinese flowering cabbage;Cytoplasmic male sterile

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.04.006

现代农业产业技术体系建设专项资金（Nycytx-35-syz19）

汪爱华（1979－），女，通信作者，博士研究生，现从事蔬菜育种研究，E-mail：wangaihualt@163.com

2010-09-16