2010年夏季急性细菌感染性腹泻患儿沙门菌感染分析

王爱敏, 何磊燕, 许学斌, 宋建明, 薛建昌, 王传清

1. 复旦大学附属儿科医院，上海 210102； 2. 上海市疾病预防与控制中心，上海 200336

沙门菌(Salmonella)是一种重要的通过食物传播的病原菌，可引起人类伤寒、副伤寒、食物中毒、胃肠炎、败血症和局部感染等多种疾病。在某些情况下，尤其是在儿童、老年人和免疫缺陷患者中，非伤寒沙门菌(non-typhoidalSalmonella，NTS)导致的侵入性和病灶性感染十分严重[1]。沙门菌病是世界 各地的常见病和多发病，欧美地区发病率为10/10万～83/10万[2]。目前已知的沙门菌血清型有2 587种[1]，且抗原变异多。不同血清型沙门菌对抗菌药物的敏感度存在差异。为了解本院沙门菌感染的现状及耐药特点，我们对2010年夏季急性细菌感染性腹泻患儿进行肠道沙门菌感染监测，并对该菌的耐药性进行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2010年7月1日～9月30日复旦大学附属儿科医院门诊及住院急性细菌感染性腹泻患儿粪便标本，进行沙门菌分离、培养和鉴定。儿童急性细菌感染性腹泻的诊断标准为：大便形状改变，呈稀便、水样便、黏液便或脓血便，大便次数比平时增多，病程在2周内。粪便常规检查发现白细胞增多或有吞噬细胞[3]。患儿均为发病当日或次日就诊, 就诊前未使用过抗生素。

1.2 方法

1.2.1 分离、培养及生化鉴定[2]采用沙门菌直接筛选、分离、培养结合增菌的培养法。材料包括木糖赖氨酸脱氧胆酸钠(xylose-lysine-desoxycholate，XLD)琼脂平板、亚硒酸盐煌绿(selenite brilliant green, SBG)增菌液肉汤、沙门菌显色平板(CHROMAgar Salmonella，CAS)显色培养基、肠道综合发酵管等，由上海美翔生物技术有限公司提供。将新鲜粪便拭子接种于XLD琼脂平板，然后将粪便拭子放入SBG液体培养基中充分搅动后取出；将XLD分离平板和SBG增菌管置37 ℃温箱培养18～24 h，挑取XLD平板中心黑色边缘较透明或浅红色的可疑菌落接种于CAS平板和双糖管中，置37 ℃温箱培养18～24 h，进行初步沙门菌鉴定；同时将培养过夜的SBG增菌液转种到XLD平板，采取同样的培养条件及初步鉴定法对沙门菌进行再次筛查、培养及鉴定。沙门菌在CAS平板呈酒红色，糖初筛试验符合K/A、H2S+/-、动力+、吲哚-、蔗糖-。采用血清学凝集试验进行确诊及血清型分型。

1.2.2 血清学分型试验 用针对沙门菌群(A～F)抗原、菌体(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清对沙门菌进行血清型鉴定。方法为挑取双糖斜面上少量菌苔与A～F多价抗血清在室温下进行玻片凝集，1 min内出现凝集颗粒为阳性；按同样方法与O单价抗血清进行逐一凝集来确定O抗原，根据确定的O抗原进行相应的H多价和单价血清凝集以确定最终血清型。玻片凝集时需设生理盐水对照和标准菌株对照。标准菌株为ATCC 14028。沙门菌诊断血清为兰州生物制品研究所和宁波天润生物技术有限公司产品。

1.2.3 药敏试验 采用Kirby-Bauer纸片扩散法。药敏试验用MH琼脂平板为上海祥和生物有限公司产品。质控菌为ATCC 25922。根据2010年中国CHINET细菌耐药性监测网对沙门菌的监测要求，选择12种抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星、阿奇霉素、氯霉素、磺胺甲基异唑-甲氧苄啶、阿莫西林-克拉维酸、头孢哌酮-舒巴坦、头孢美唑和磷霉素。抗菌药物纸片为英国Oxoid公司或美国BBL公司产品。按美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2009年M100-S19标准判断结果[4]。

1.3 统计分析

采用WHONET5.3分析细菌对抗菌药物的耐药性，组间差异采用SPSS16.0 χ2检验。

2 结果

2.1 不同年龄组患儿沙门菌分离率

患儿年龄0～16岁。于2010年7月1日～9月30日收集门诊及住院急性细菌感染性腹泻患儿粪便标本1 045例，共分离出沙门菌160株，总分离率为15.3%。其中收集<1岁患儿粪便标本505例，分离出沙门菌119株，分离率为23.6%；收集1～5岁患儿粪便标本423例，分离出沙门菌32株，分离率为7.6%；收集>5岁患儿粪便标本117例，分离出沙门菌9株，分离率为7.7%。

2.2 沙门菌血清分型

对分离出的160株沙门菌进行血清学分型实验，共鉴定出21种沙门菌血清型，另有4株暂未鉴定到种。其中鼠伤寒沙门菌65株，占40.6%；肠炎沙门菌40株，占25.0%。两者共占65.6%，为主要的沙门菌株。少见的沙门菌有阿尔巴尼沙门菌、伊鲁慕沙门菌、巴雷利沙门菌、罗森沙门菌、姆班达卡沙门菌、奥道奈兹沙门菌等。有4例沙门菌未鉴定到种。菌种分布见表1。鼠伤寒沙门菌中，<1岁患儿46例，占70.8%；1～5岁患儿15例，占23.1%；>5岁患儿4例，占6.2%。<1岁患儿感染鼠伤寒沙门菌的比率与1～5岁患儿和>5岁患儿相比，有显著性差异(χ2=121，P<0.001)。肠炎沙门菌中，<1岁患儿19例，占47.5%；1～5岁患儿16例，占40%；>5岁患儿5例，占12.5%。年龄分布亦有明显差异(χ2=78，P<0.001)。

表1 临床分离沙门菌的菌种分布

Tab.1 Distribution of clinical isolates ofSalmonellaspp.

Microorganism Number of strainsPercent (%)Salmonella typhimurium6540.6Salmonella enteritidis4025Salmonella agona85Salmonella saintpaul53.1Salmonella meleagridis53.1Salmonella senftenberg42.5Salmonella paratyphi B42.5Salmonella infantis42.5Salmonella irumu31.9Salmonella aberdeen31.9Salmonella thompson21.3Salmonella stanley21.3Salmonella derby21.3Salmonella braenderup21.3Salmonella anatum10.6Salmonella potsdam10.6Salmonella albany10.6Salmonella bareilly10.6Salmonella rissen10.6Salmonella mbandaka10.6Salmonella ordonez10.6Salmonella spp.42.5Total160100

2.3 2种常见沙门菌对抗菌药物的耐药性

鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌对氨苄西林的耐药率分别高达91.4%和69.0%；对第3代头孢菌素的耐药率，鼠伤寒沙门菌接近30%，而肠炎沙门菌不超过7%；鼠伤寒沙门菌对磺胺甲基异唑-甲氧苄啶耐药率亦高达82.8%，对含酶抑制剂青霉素类、氯霉素及磺胺甲基异唑-甲氧苄啶的耐药率均高于肠炎沙门菌；2种沙门菌对喹诺酮类、大环内酯类、头霉素类、磷霉素及头孢哌酮-舒巴坦的耐药率均较低(表2)。结果显示，鼠伤寒沙门菌对以上12种抗生素耐药率在3个年龄组中的分布均有显著性差异(P<0.001)，肠炎沙门菌对以上12种抗生素耐药率在3个年龄组中的分布也有显著性差异(P<0.001)。在鼠伤寒沙门菌中，发现3例广泛耐药菌株，其对氨苄西林、第3代头孢菌素、喹诺酮类、大环内酯类、头霉素类药物均耐药。未发现广泛耐药的肠炎沙门菌。

3 讨论

腹泻是儿童常见疾病，尤其在发展中国家。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计，发达国家每年约30%的人患食源性疾病[5]；发展中国家更严重，估计每年腹泻及相关疾病有217亿病例，导致240万5岁以下儿童死亡。美国于1996～1999年调查的7种(空肠弯曲菌、大肠埃希菌O157：H7、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、李斯特菌和小肠结肠炎耶尔森菌属)细菌性食物中毒中，沙门菌位居第2位(33%)。1989～1990年日本检出结果显示，沙门菌占肠道病原菌的首位。我国多年来沙门菌食物中毒一直居细菌性食物中毒的首位(64%)[2]。我院调查也显示，2010年夏季急性细菌性腹泻患儿中沙门菌感染率超过15%。

沙门菌感染全年均可发病，夏季是感染高峰，婴幼儿是易感人群。有报道显示，在沙门菌感染病例中，<1岁患儿占81.4%[6]。本次资料显示，在所有沙门菌感染病例中，<1岁患儿占74.4%(119/160)，符合沙门菌感染的患者年龄特征。

表2 沙门菌对抗菌药物的敏感率和耐药率

Tab.2 Sensitivity and resistance rates ofSalmonellaspp. to antimicrobial agents

AntibioticSalmonella typhimuriumS(%)R(%)Salmonella enteritidisS(%)R(%)Salmonella spp.S(%)R(%)Ampicillin8.691.431.069.067.532.5Ampicillin-sulbactam17.550.975.9075.012.5Cefotaxime62.129.389.76.982.512.5Ceftriaxone65.529.393.16.985.015.0Ciprofloxacin48.36.996.6090.010.0Azithromycin83.38.386.710.389.310.7Chloramphenicol31.06993.13.477.520.0Sulfamethoxazole-trimethoprim17.282.889.710.356.441.0Amoxycillin-clavulanic acid34.536.279.3072.520.0Cefoperazone-sulbactam79.3089.701000Cefmetazole93.16.9100095.55.0Fosfomycin100010001000

S, sensitivity rate; R, resistance rate.

自1993年以来，非伤寒沙门菌感染以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为主[7]。此次调查共分离到21种血清型，其中鼠伤寒沙门菌占40.6%、肠炎沙门菌占25.0%，两者占总分离率的65.6%。深圳于2009年分离到的沙门菌中，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌占58.8%[8]。2008年北京夏季沙门菌感染中，亦以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为主，共占71.06%[9]。提示我国目前流行的沙门菌血清型为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌。<1岁患儿感染鼠伤寒沙门菌的比率明显高于1～5岁和>5岁患儿。此次分离到6种少见的血清型，有4种沙门菌未鉴定到种。

沙门菌是人畜共患病的致病菌。长期以来，为治疗、预防疾病和促进畜禽生长，抗生素广泛添加到动物饲料中，致使沙门菌耐药性不断上升。耐药的沙门菌通过畜禽再传播给人类，已成为严重的公共卫生问题。特别是鼠伤寒沙门菌对氯霉素、氨苄西林等普通抗生素及磺胺类药物普遍耐药，对氟喹诺酮类药物耐药的病例亦日益增多，对第3代头孢菌素亦出现耐药。在欧洲，40%的沙门菌分离株至少对1 种抗生素耐药，18%的分离株为多重耐药(muitidrug resistance，MDR)表型[10]。在非洲，沙门菌对氯霉素、磺胺甲基异唑-甲氧苄啶、氨苄西林的耐药率为36%～59%[11]。国内一项调查显示，2003～2008年鼠伤寒沙门菌对氨苄西林的耐药率从4.4%增至51.4%，对头孢噻肟的敏感率从100%降至82.8%，对磺胺甲唑/甲氧苄啶的敏感率从100%降至52.8%[12]。一项上海市鼠伤寒沙门菌流行研究显示，鼠伤寒沙门菌临床病例腹泻株在2005～2007年对磺胺类药物的耐药率从17.4% 上升至35.5%，多重耐药株从2005年的1株上升至2007年的6株，对第3代氟喹诺酮类药物也有5.7%～9.7%的低水平耐药，对第3代头孢菌素未见耐药[13]。而在本次研究中，鼠伤寒沙门菌的耐药率普遍高于其他沙门菌。其对氨苄西林的耐药率已高达91.4%；对磺胺甲基异唑-甲氧苄啶耐药率亦高达82.8%；对第3代头孢菌素如头孢噻肟、头孢曲松的耐药率也接近30%；对环丙沙星呈低度耐药，耐药率为6.9%。沙门菌对头孢哌酮-舒巴坦、头孢美唑、磷霉素仍高度敏感。

目前多重耐药菌十分猖獗，多重耐药的发生率近年来显著增长，原因之一就是具有多重耐药性的鼠伤寒沙门菌DT104在全球范围内传播。沙门菌的耐药性主要由质粒介导，其多重耐药性的获得主要与质粒基因和染色体基因突变有关。多重耐药的水平转移通常是由质粒、转座子或整合子内的基因盒介导。高耐药和多重耐药鼠伤寒沙门菌(如DT104) 的出现是多种耐药机制协同作用的结果。质粒介导耐药性使耐药菌株迅速扩散、蔓延，导致防治困难，因此细菌的高耐药率亟待解决[14]。耐药细菌通常通过食物链传播给人[15]，因此动物源性沙门菌新的耐药机制的出现，将直接决定人源性沙门菌的耐药性。我们必须积极开展沙门菌耐药机制研究和流行病学调查，遏制不合理的抗生素应用，持续监测沙门菌的耐药性变化。临床医师在选择药物时，应主要参考本地区某一时段的耐药性监测结果，制订治疗方案，避免盲目使用及滥用抗生素。

[1] Abbassi-Ghozzi I, Jaouani A, Aissa RB, Martinez-Urtaza J, Boudabous A, Gtari M. Antimicrobial resistance and molecular analysis of non-typhoidal Salmonella isolates from human in Tunisia [J]. Pathol Biol (Paris), 2010, 59(4): 207-212. doi:10.1016/j.patbio.2010.06.001.

[2] 朱超,许学斌. 沙门菌属血清型诊断[M]. 上海: 同济大学出版社, 2009，387-390.

[3] 胡亚美，江载芳. 诸福堂实用儿科学[M]. 第7版.北京：人民卫生出版社，2009,1286-1299.

[4] Clinical and Laboratory Stanards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [S]. 2009, M100-S19. http://std.kku.ac.th/4930901269/4.pdf

[5] World Health Organization. WHO global strategy for food safety: safer food for better health[EB/OL]. Geneva, 2002. http://www.who.int/foodsafety/publications/general/ global_strategy/en/.

[6] 林伟雄，丘芸，王宗杰.腹泻儿童大便沙门菌培养及药敏分析[J].中国社区医师， 2010， 19 (12)：157.

[7] Hopkins RS, Jajosky RA, Hall PA, Adams DA, Connor FJ, Sharp P, Anderson WJ, Fagan RF, Aponte JJ, Nitschke DA, Worsham CA, Adekoya N, Chang MH; Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Summary of notifiable diseases——United States, 2003 [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2005, 52(54): 1-85. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5254al. htm.

[8] 邱亚群,林一曼,扈庆华,石晓路,李迎慧,刘涛.深圳市119 株沙门菌的菌型分布及耐药情况分析[J]. 实用预防医学[J]，2010，17(8)：1644.

[9] 于国慧,董方,甄景慧,刘锡清,许宏,宋文琪,徐樨巍. 北京地区儿童感染性腹泻病原学和耐药性分析[J]. 临床儿科杂志，2010, 28(6)：535-538.

[10] Cebrián L, Rodríguez JC, Escribano I, Royo G. Characterization of Salmonella spp. mutants with reduced fluoroquinolone susceptibility：importance of efflux pump mechanisms [J]. Chemotherapy，2005，51(1)：40-43.

[11] Fashae K, Ogunsola F, Aarestrup FM, Hendriksen RS. Antimicrobial susceptibility and serovars of Salmonella from chickens and humans in Ibadan, Nigeria [J]. J Infect Dev Ctries, 2010, 4(8): 484-494.

[12] 炊慧霞,张秀丽,廖兴广,银恭举,胡巅,张蒙,张广伟. 河南省2003～2008 年食源性沙门菌耐药性变迁研究[J]. 现代预防医学，2010，37(18)：3542-3543.

[13] 许学斌, 金汇明, 肖文佳, 陈敏, 冉陆, 刁保卫, 崔志刚, 阚飚.上海市鼠伤寒沙门菌流行特征及分子分型研究[J]. 上海预防医学杂志, 2010, 22(2): 57-61.

[14] 郭云昌,刘秀梅. 鼠伤寒沙门菌多重耐药性机制研究进展[J].中国食品卫生杂志,2004, 16(5): 456-458.

[15] Böltner D, MacMahon C, Pembroke JT, Strike P, Osborn AM. R39: a conjugative integrating mosaic comprised of phage, plasmid, and transposon elements [J]. J Bacteriol, 2002, 184(18): 5158-5169.