2007-2008年上海市 H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化＊

葛菲菲,刘 健,鞠厚斌,张维谊,周锦萍

2007-2008年上海市 H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化＊

葛菲菲,刘 健,鞠厚斌,张维谊,周锦萍

目的 对分离自上海活禽批发市场的11株 H9N2亚型A IV(2007年5株、2008年6株)进行了 PB2,PB1,HA,NP和NA的测序,以阐明2007年至2008年上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将 H9亚型荧光RT-PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,H I进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这11个毒株的PB2,PB1,HA,NP和NA并进行了序列测定。结果对 HA基因进行遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck/Bei/1/94系。这11个毒株的5个片段的组成有两种方式。结论上海活禽批发市场的11株 H9N 2亚型A IV毒株中已包含了 H5的片段,所以在今后的工作中加强 H9N2亚型禽流感流行病学监测是非常必要的。

H9N2亚型禽流感;测序;遗传发生关系

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza,A I)引起的禽类的一种传染病[1]。目前,根据表面糖蛋白血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,A IV可以分为 16种 HA亚型和 9种 NA亚型。其中H 9N 2亚型禽流感病毒一般在鸡群呈隐性感染状态,较为明显的症状是能引起轻微的呼吸道症状,但是影响产蛋鸡的产蛋量和肉鸡的增重,特别是与其他病毒和细菌混合感染时,呈协同作用,引起发病率和致死率升高[2]。研究表明,H9N2亚型禽流感病毒是我国主要的流行毒株[3]。然而,1999年被发现的 H9N2亚型A IV可突破种间屏障传染人和猪[4]。该病毒粒子表面镶嵌着2种重要的纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),它们与病毒的毒力、传播关系密切。HA在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用,它刺激机体产生中和抗体,可中和病毒的感染[5-7]。本研究对上海地区2007-2008年分离自活禽市场的11株 H9N2亚型A IV毒株的PB2,PB1,HA,NP和NA进行了测序,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解上海地区该亚型禽流感病毒的分布及流行规律[8]。

1 材料与方法

1.1 病毒和鸡胚 A/Chicken/Shanghai/Q0702/07(简写为Ck/SH/Q0702/07);A/Chicken/Shanghai/Q0704/07(简写为Ck/SH/Q0704/07);A/Chicken/Shang hai/Q0707/07(简写为Ck/SH/Q0707/07);A/Chicken/Shanghai/Q0709/07(简写为Ck/SH/Q0709/07);A/Chicken/Shanghai/Q0712/07(简写为 Ck/SH/Q0712/07);A/Chicken/Shanghai/Q0801-1/08(简写为 Ck/SH/Q0801-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0801-2/08(简写为Ck/SH/Q0801-2/08);A/Chicken/Shanghai/Q0808-1/08(简写为Ck/SH/Q0808-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0808-2/08(简写为 Ck/SH/Q0808-2/08);A/Chicken/Shanghai/Q0812-1/08(简写为Ck/SH/Q0812-1/08);A/Chicken/Shanghai/Q0812-2/08(简写为Ck/SH/Q0812-2/08);由本实验室于2007年至2008年从上海地区的活禽批发市场分离、鉴定。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。H9荧光RTPCR试剂盒由深圳匹基提供。新城疫阳性血清,禽流感血凝素分型血清(H5、H9)由哈尔滨兽医研究所提供。AMV反转录酶等试剂均购自宝生物(大连)工程公司;特异引物由宝生物(大连)工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的初步鉴定 首先对鸡气管和泄殖腔样品用H9荧光RT-PCR试剂盒进行检测,将 H9阳性样品处理后接种鸡胚尿囊腔,将分离毒尿囊液应用β-微量法进行 HA试验,以检测其血凝性及 HA效价。根据 HA试验中所测得的 HA效价,将分离毒尿囊液配制成4单位的溶液,分别用新城疫阳性血清,禽流感 H5和 H9阳性血清进行 H I试验,以检测该分离物的血凝性是否能被禽流感 H9阳性血清所抑制,详细步骤按照GB/T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术。

1.2.2 引物的设计及合成 根据 GeneBank上已发表的序列,针对其5个基因片段 PB2,PB1,HA,NP和NA基因分别设计了相关引物。由于PB2和PB1基因片段较长,所以分成两段进行扩增,引物由上海英骏生物技术有限公司合成 ,见表 1。

表1 引物序列和目的片段长度Table 1 Primer sequence and am plified product length

1.2.3 病毒RNA的提取和 RT-PCR扩增 用病毒 RNA提取试剂盒提取病毒基因组 RNA,具体步骤按照说明书进行。采用20μL的cDNA合成体系置于0.2m L反应管中,取溶于DEPC处理水中的A IV RNA样品9μL,分别加入上游引物3μL,5倍 RT-PCR缓冲液4μL,dNTPs(10 mmol/L)2.5μL,RNA酶抑制剂0.5μL,AMV反转录酶2μL,用无RNase的超纯水加至总体积为20μL,置于 PCR仪中进行cDNA合成,以30℃10 min,42℃60 min,进入 PCR扩增。PCR反应体系100μL:在 PCR反应管中分别加入cDNA 10 μL,上、下游引物各 3μL(20 pmol/μL),10 ×LA PCR Buffer10μL,dNTPs(2.5mmol/L)10μL,M gCl2(25 mmol/L)8μL,LA Taq DNA 聚合酶 0.5μL(5U/μL),灭菌超纯水加至100μL,置于PCR仪中进行PCR扩增。首先95℃预变性2min,然后进行以94℃30s,55℃60s(HA,PB1前半段,PB1后半段,NP这4个基因的退火温度为55℃,NA,PB2前半段和PB2后半段退火温度为52℃),72℃180s的 PCR循环,进行40个循环后于72℃延伸10min。

1.2.4 基因片段的cDNA克隆、鉴定和测序 RT-PCR产物电泳经凝胶回收后,按pMD 18-T载体说明书进行连接、转化,用 Eco RI和 H in d进行双酶切鉴定;鉴定为阳性克隆后送英骏生物有限公司测序。

1.2.5 基因cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析比较 借助DNA Star4.0分析软件,通过Jotun Hein方法分析比较所得序列的同源性以及一些关键位点的变化情况。1.2.6 绘制系统发育树 借助M EGA 3.1分析软件,确定这11个毒株PB2,PB1,HA,NP和NA 5个基因片段的遗传分类情况。

2 结 果

2.1 病毒的初步鉴定结果 这11株病毒感染的鸡胚尿囊液血凝性能够被 H9型阳性血清所抑制,而不能被 H5型阳性血清所抑制,表明这11株病毒均为 H 9亚型。

2.2 PB2,PB1,HA,NP和NA基因cDNA RTPCR扩增 以病毒RNA为模板,利用特异性引物,通过RT-PCR方法均扩增出特异性条带,其大小与预期完全相符。

2.3 cDNA全序列同源性比较以及一些关键位点的分析 11株 H9N2亚型A IV的HA基因详细分析见《2007-2008年上海地区 H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析》(中国动物传染病学报,2010,18(4):41-46)。这11株病毒在NA基因颈部均存在9个核苷酸的缺失(206-214位)。所有毒株的PB2蛋白627位氨基酸和701位氨基酸均为 E和D,表明这些毒株均为禽源。这11株 H9N 2亚型A IV毒株的NA,NP,PB2和PB1基因核苷酸序列同源性分别为93.7～99.8%,91.1～99.9%,85.3～99.9%和92.1～100%。

2.4 绘制系统发育树 借助M EGA 3.1分析软件,建立 H 9N 2亚型禽流感病毒 PB2,PB1,HA,NP和NA的系统发育树,见图1。

2.5 11株分离株的5个基因片段的遗传发生关系

对2007年分离的5株,2008年分离的6株进行了 HA,NA,PB1,PB2和NP5个基因片段的进化树分析,各片段所属基因型如表2所示。除了 Ck/SH/Q0707/07和Ck/SH/Q0709/07这两个毒株的PB2基因属于Ck/Bei/1/94系,其余9个毒株的5个基因片段组成方式均相同。

表2 H9亚型禽流感病毒的基因分型Table 2 The genotypes of H9N2 subtype avian influenza virus

3 讨 论

总的来说,11株毒株均为重组体。通过基因序列分析,上海地区2007-2008年分离的这11株H9N2亚型禽流感 HA基因同源性最高达到99.5%,推导的氨基酸同源性最高为99.6%;该研究的11个分离株均为低致病性禽流感病毒[9]。

这11株病毒在NA基因颈部均存在9个核苷酸的缺失(206-214位),有研究报道表明Ck/Bei/1/94病毒的NA基因可能是该分支中其它病毒NA基因的祖先,在其进化过程中发生了该部位的核苷酸缺失,这也进一步说明NA基因颈部的某些区段对于流感病毒的复制并不是必须的,可以通过对流感病毒颈部进行修饰,用于开发流感病毒载体。刘金华等[10]报道在我国分离到的12株 H 9N 2亚型禽流感病毒的NA基因颈部都存在着9个核苷酸的缺失,并被认为是我国 H9N 2亚型禽流感病毒的一个分子标签。

2007年分离的5个毒株,其5个测序片段(HA,NA,PB1,PB2和NP)的组成方式有两种,到2008年时,只有一种,表明随着时间的改变,基因型是在逐渐改变的,而且主要发生在 PB2基因由Ck/Bei/1/94系转变成Qa/H K/G1/97系。

上海地区分离的这11个毒株均属于Ck/Bei/1/94系,与目前在上海使用的疫苗株Ck/SD/6/96同属于一个谱系,在某种程度上表明现有的疫苗在H9N 2亚型禽流感防控中仍起着作用,但其内部基因片段已发生明显变化,所以在今后的工作中加强H9N2亚型禽流感流行病学监测是非常必要的。

图1 2007-2008年中国上海地区 H9N2亚型禽流感病毒NA(59-1235位核苷酸),NP(2-1445位核苷酸),PB1(182-1080位核苷酸)和PB2(32-2228位核苷酸)的基因进化树。本研究中的11株病毒和疫苗株用粗体标记。Fig.1 Phylogenetic trees of the NA(positions59 to 1235),NP(positions2 to 1445),PB1(positions182 to1080)and PB2(positions32 to 2228)genes of the H9N2 avian influenza viruses in Shanghaiof China from 2007 to 2008.The method used is described in the legend to Fig.4.Viruses characterized in this study are highlighted in bold and the vaccine strain is in bold.＊BJ:Bei,Beijing;CA:California;Ck,chicken;Dk,duck;GD,Guangdong;Gf,guinea fow l;Gs:Goose;GX,Guangxi;GZ,Guangzhou;HK,Hong Kong;HLJ,Heilongjiang;JS:Jiangshu;NC,Nanchang;NJ,Nanjing;Pg,pigeon;Ph,pheasant;Qa,quail;SD,Shandong;SH,Shanghai;ST,Shantou;Ty,turkey;VNM,Vietnam;WDk,wild duck;W I,W isconsin;YN,Yunnan

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Phylogenetic analysis of H9N2 subtype avian influenza virus isolates in Shanghaiarea from 2007 to 2008

(Shanghai Center for A nim a l D isease Control and Prevention,Shanghai 201103,China)

GE Fei-fei,L IU Jian,JU Hou-bin,ZHANGWei-yi,ZHOU Jin-ping

In order to exp lore the genetic variation and molecular characteristics of H9N2 subtype avian influenza viruses in Shanghaiarea from 2007 to 2008,eleven H9N 2 subtype avian influenza viruses(A IV s)were isolated from live poultry markets of Shanghai including five isolates from 2007 and six isolates from 2008.These specimenswere paired tracheal and cloacal swabs.Eleven strains of influenza A viruses were determined as H9 subtype by fluorescence RT-PCR kit and then isolated by using 10-day-old specific-pathogen-free chicken eggs.They were further identified as H9 subtype by H I test.The cDNA of PB2,PB1,HA,NP and NA were amp lified by RT-PCR and sequenced.Phylogenetic analysis of the H9 HA gene showed that all of the H9 viruses are incorporated with the lineage rep resented by Ck/Bei/1/94.There are two typesof segment formulation among these isolates.H5 segment have already reassorted with these H9N2 A IV,so it is necessary to enhance epidemiological survey of H9N 2 A IV.

H9N2 subtype avian influenza;sequence analysis;phylogenetic relationship

S852

A

1002-2694(2011)08-0696-04

＊上海市科技兴农重点攻关项目“上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分子变异和免疫技术的研究”(No.2007(3-4))资助

周锦萍,Email:qyfgff2369@yahoo.com.cn

上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103

2011-02-15;

2011-04-17