肠道病毒EV71型浙江分离株 HZ08全基因组序列分析＊

谢荣辉,朱函坪,黄潇潇,杨章女,徐 芳,姚苹苹,朱智勇

肠道病毒EV71型浙江分离株 HZ08全基因组序列分析＊

谢荣辉1,朱函坪1,黄潇潇2,杨章女1,徐 芳1,姚苹苹1,朱智勇1

目的 了解浙江省流行的肠道病毒71型 HZ08株的基因特征,研究肠道病毒71型的进化及变异状况。方法设计特异性引物,RT-PCR扩增HZ08株全基因,PCR产物纯化后克隆于 T载体并进行序列测定和基因进化分析。结果HZ08株的全基因组由7 405个核苷酸组成,编码2 193个氨基酸。HZ08的5非编码区(UTR)、VP1、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非编码区(U TR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的毒株序列较高,分别为96.2%～99.1%,92.6%～99.1%,92.7%～98.4%,88%～99.2%,93.8%～99.5%,89.4%～99.2%,91.4%～98.8%,87.8%～100%和91.1%～98.9%。HZ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%。根据VP1基因和全基因序列进行种系统发生分析显示 HZ08株与中国陆和台湾的病毒进化关系较近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系统较远。其中 HZ08株与国内流行株BJ08和Fuyang08的进化关系最近。HZ08株与C4亚型相关氨基酸序列一致,VP1的抗原性表位发生了变异。结论HZ08病毒分离株为C4亚型,与Fuyang08和BJ08株进化途径相同,为肠道病毒71型的基因组功能学和疫苗学研究奠定基础。

肠道病毒71型;全基因组;序列分析

肠道病毒71型(EV 71)自1969年自次分离以来,其感染已在世界范围内引起多次暴发与流行[1-2]。EV 71是引起手足口病的主要病原体之一,也可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎等多种与神经系统相关的疾病[3]。自2008年以来,我国多个地区出现了EV 71引起的手足口病疫情,导致多名患者的死亡。因此加强对EV 71的分子生物学研究势在必行,本研究通过长距离 RT-PCR扩增 EV 71全基因,并对全基因序列进行测定和分析,为开展病毒变异、毒力及其疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 肠道病毒71型病毒株由本实验室自2008年手足口患者分离而来,并在Vero中进行扩增。

1.2试剂 RNA提取试剂盒(Rnasy mini Kit)购自Qiagen公司;PrimeScrip t reverse Transcrip tase,PrimeSTAR HSDNA polymerase,胶回收试剂盒、DNA片段回收试剂盒均购自宝生物工程有限公司;质粒载体p GEM-T试剂盒购自Promega公司。

1.3 引物设计和合成 根据 GenBank中肠道病毒EV-7型的全基因序列设计一对引物,上游引物EV 71-FF: 5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3′,下游引物 :EV 71-FR:5′-GCT A TTCT GGTTA TAACAAA TTTACCCCCAC-3′。引物由上海生工合成。

1.4 RT-PCR扩增基因片断 按照 Rnasy M ini Kit说明书提取病毒RNA。按照 PrimeScrip t reverse Transcrip tase说明书操作,先以 EV 71-FR为反转录引录,在42℃反应1h反转录全长cDNA,然后利用PrimeSTAR HSDNA polymerase进行基因组全长扩增。PCR反应条件为:94℃预变性1min;98℃10s,56℃15s,72℃7m in30s,35个循环;72℃10min。反应产物在1%琼脂糖凝胶电泳中进行检验。

1.5 全长cDNA的构建与鉴定 RT-PCR扩增产物割胶回收后,产物按照 Taq酶说明书加Po lA尾,反应体系如下:PCR产物40μL,dN TP 4μL,Taq酶1μL,10×buffer 5μL。72℃反应 30min。反应产物用DNA片段回收试剂盒进行纯化,以 TA克隆方法将EV 71全长基因组连入PGEM-T-Easy载体中,抽提质粒用PCR法鉴定是否插入目的片段。

1.6 序列测定和分析 筛选的阳性克隆经PCR鉴定,各选2株送上海生工生物工程有限公司测序,用DNAStar和 Clustal X生物软件对其进行序列分析。

2 结 果

2.1 RT-PCR结果 从Vero细胞培养的肠道病毒EV 71病毒中提取RNA,并以此为模板进行RTPCR,产物经琼脂糖凝胶电游泳检测,有1条大小为7 400bp左右的电泳带,与预期大小相符。

图1 EV71病毒全基因扩增结果M:Wide Range DNA Marker(500～12 000),1:PCR产物Fig.1 RT-PCR analysis of the full-length genome of the HZ08 stra in

2.2 病毒全基因组序列测定结果 经过序列测定和分析后,获得 EV 71病毒 HZ08株的全基因组核苷酸序列,长度为7 405 bp。其中A占27.2%,G占23.75%,U占24.82%,C占24.23%。腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富。其中5非编码区含有742个核苷酸,3非编码区含有81个核苷酸。开放读码框从473位至7 324位,共6 582个核苷酸,编码2 193个氨基酸。

2.3 病毒基因组核苷酸及氨基酸同源性比较 将HZ08与其他毒株进行同源性分析发现,HZ08株全基因水平上与SHZH 98与 Fuyang08等C4基因亚型的毒株其同源性较高,而与C1,C2,C5等基因亚型毒株、B基因型及A基因型毒株的核苷酸同源性较低,其中 HZ08株与我国的中国大陆安徽阜阳毒株Fuyang08非常接近,整个基因组核苷酸同源性98.9%。同时也通过对VP1,VP2,VP3,VP4,P2及P3各区段的核苷酸和氨基酸同源性比较发现,HZ08株与C4基因亚型毒株的核苷酸同源性较高,而与C1,C2,C5等基因亚型毒株、B基因型及A基因型毒株的核苷酸同源性较低,表明 HZ08标属于C4基因亚型毒株(表1)。分析表明:虽然 EV 71基因型别之间核苷酸差异较大,但氨基酸差异较少,表明EV 71之间核苷酸变异属于沉默变异,不导致氨基酸的变化。

2.4 系统进化树分析 根据VP1核苷酸序列的同源性,将 EV 71划分为A、B、C3个基因型,B、C基因型又分为B1-B5和C1-C5亚型。本研究按照VP1和全基因核苷酸序列构建进化树。结果显示,HZ08株与中国分离株病毒进化关系较近,其中 HZ08株与Fuayang 08株进化关系最近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系较远。

2.5 VP1区亚型相关表位和抗原性表位相关的氨基酸序列分析 研究表明VP1区存在6个与病毒亚型相关的氨基酸序列[4],本研究发现 HZ08与C4亚型的参考毒株序列的氨基酸组合模式相同,均为43位的 K,58位的A,164位的D,184位的 S,240位的 T及249位的V。VP1区的92-107位氨基酸为EV 71特异性抗原表位,经过序列比较发现该区域的 98位存在着高度变异,其中 HZ08、Chongqing1-09-china和Lanzhou01株98位为K,而BJ08、GZ-08-1和 GDFS-3株在 98位则为 E,但该区域的其他位点则具有高度的特异性。

表1 HZ08株与各株基因亚型参考株的核苷酸序列同源性(%)比较Table 1 Comparison of the nucleotide sequence between the HZ08 and other enterovirus

图2 HZ08株EV71病毒VP1基因和全基因序列系统发生树Fig.2 Phyogenetic tree based on the VP1 gene and the full-length genome between HZ08 and other strains

3 讨 论

本研究利用长距离RT-PCR方法扩增肠道病毒 EV 71全长 cDNA的片段,为制备肠道病毒EV 71感染性转录体奠定了基础。为了保持全长cDNA的忠实性,本研究采用高可信度的 Prime-STAR HSDNA polymerase进行实验,该酶具有极强的3′→5′Exonuclease活性而显示出超群的校正功能,具有很高的可信性。同时本研究扩增了EV 71浙江分离株 HZ08的全基因并对病毒核苷酸序列进行测定分析,有助于完善我国 EV 71病毒株的基因信息,为以后开展灭活疫苗、减毒疫苗以及全基因组功能学等研究作奠定了基础。

按照VP1基因核苷酸序列的同源性,目前将EV 71划分为 A、B、C3个基因型[5]。A基因型为EV 71的原形病毒,只包含一个单独的病毒株B rCr;B基因型可进一步分为B1-B5基因亚型,主要包括美国、澳大利亚、哥化比亚、部份新加坡、中国台湾和马来西亚的病毒株;C基因可划分为C1-C5基因亚型,主要包括美国、澳大利亚、中国大陆与台湾、加拿大、新加坡和马来西亚的病毒株[6-7]。研究资料显示,目前在我国大陆地区流行的 EV 71毒株主要为C4亚型病毒株。本研究结果表明:HZ08株与A基因及B基因型毒株在VP1的核苷酸差异均在15%以上,而与C基因型病毒株在VP1区段核苷酸差异均低于12%,其中与C4亚型各病毒株的同源性较高,表明 HZ08属于C4亚型毒株。从VP1和全基因核苷酸序列构建的系统进化树显示,HZ08株与Fuyang08等国内分离株的亲缘关系较近,而与国外分离株的亲缘关系较远,具有明显的地域性。但也有研究表明,肠道病毒之间的同源重组位点多位于非结构编码区[7],如果仅以VP1作为分型依据,则会忽略EV 71其他基因变异的信息,不能真实反映病毒之间在自然界中的变异状况。进行全基因研究不仅可以了解其他区段的基因序列情况,也能反应不同基因型别的同源性。本研究结果显示:C基因型的 HZ08株与A、B基因型毒株在VP1基因的同源性要高于全基因的同源性,表明 EV 71毒株在其他基因区域存在着高度变异,VP1基因不能完全反映病毒毒株在自然界重组等变异状况的发生。

有研究表明:VP1区的92-107位氨基酸为EV 71的主要抗原表位,而且此区域高度保守[8]。但本研究发现国内部分分离株在此区域的98位发生了变异,由 E突变为 K,此位点的改变对病毒抗原性和毒力的影响如何有侍于进一步研究。

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Com plete genome sequence analysis of the en terovirus 71 HZ08 strain isolated in Zhejiang

X IE Rong-hui1,ZHU Han-ping1,HUANG Xiao-xiao2,YANG Zhang-nü1,XU Fang1,YAO Ping-ping1,ZHU Zhi-yong1

(1.Zhejiang Provincial Center for D isease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China;2.The Six th Peop le’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310014,China)

To study the comp lete genome sequence of entrovirus 71 HZ08 strain gene isolated in Zhejiang p rovince and exp lo re its evolution.The total RNA was prepared from enterovirus 71 HZ08 strain and the RT-PCR productswere cloned into T vecto r,sequenced and analyzed.The result of sequencing of the nucleotides showed that the complete gene of the HZ08 strain was 7405 bp in full length encoding 2193 amino acids.Data from sequences analysis showed that HZ08 shared 96.2%-99.1%,92.6%-99.1%,92.7%-98.4%,88%-99.2%,93.8%-99.5%,89.4%-99.2%,91.4%-98.8%,87.8%-100%and 91.1%-98.9%in 5U TR,VP1,VP2,VP3,VP4,P2,P3,3U TR and complete genome with C4 subtype,respectively.HZ08 showed low nucleotides identity(<90%)with o ther subtypes.Phylogenetic trees established from alignment of the complete genome and VP1 region indicated that HZ08 shared the near genetic relationship with EV 71 isolated in china.HZ08 and other C4 subtype strains shared the same amino acids in 6 sites in VP1 region,which were associated with EV 71 subtype.There was one mutation in VP1 antigen epitope.The HZ08 strain belonged to the same genogroup with Fuyang08 and Henan08 strains as C4 gene subtypes.

Enterovirus 71;comp lete genome;sequence analysis

R373

A

1002-2694(2011)08-0679-04

＊浙江省医药卫生科技项目(2010B027)资助

谢荣辉,Email:ghost_rhxie@hotmail.com

1.浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;2.杭州市第六医院,杭州 310014

2011-03-14;

2011-05-16