应用鼓泡塔式反应器生产藏红花素的研究

陈书安，王晓东，袁晓凡，赵兵，王玉春

藏红花（Crocus sativus L.）被誉为“植物黄金”，是一种名贵的妇科良药，有望成为 21 世纪最理想的抗癌药物之一[1-3]。但藏红花种植条件苛刻、适宜栽培的地区有限、田间栽培过程易感染病毒，加之其柱头入药、产量极低，致使其资源短缺、价格昂贵[3-4]。通过植物细胞培养体系生产藏红花素，是解决藏红花资源短缺的有效途径之一[3]，其中生物反应器技术是其实现产业化的关键技术之一。

为建立藏红花细胞培养体系，从诱导的 229 株藏红花愈伤组织中筛选出一株藏红花素含量高、生长速度快的细胞系[4-5]；经脱毒处理，该细胞系无国内外报道的侵染藏红花的病毒[6]，经优化建立了其摇瓶培养体系[7-8]。为实现藏红花素的规模化生产，选择鼓泡塔式反应器作为研究的对象，探求其生物反应器培养的参数。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 藏红花球茎 1 细胞系，黄色，质地疏松，不透明。

1.1.2 培养基 以 B5（Gamborg，1968）[9]为基本培养基，添加 1 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）、2 mg/L 萘乙酸（NAA）和 300 mg/L 水解酪蛋白，简称 M2B5 培养基。

1.1.3 仪器 UV-2802 紫外可见光检测器为尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；2.5 L 鼓泡式生物反应器：反应器罐体高 30 cm，直径为 12 cm。

1.2 方法

1.2.1 生物量的测定方法 将藏红花细胞悬浮培养液，经8000 × g 离心 20 min，取离心沉淀的细胞置于烘箱，60 ℃烘干至恒重，称其干重即为生物量。

1.2.2 藏红花素含量测定方法 将藏红花细胞悬浮培养液，经 8000 × g 离心 20 min，回收上清液；将离心沉淀的细胞用 20 ml 50% 的甲醇在室温下摇床振荡提取 2 h 后，经 8000 × g 离心 20 min，回收上清液；将二次离心沉淀的细胞再用 10 ml 50% 的甲醇在室温下摇床振荡提取 1 h，8000 × g 离心 20 min，回收上清液。合并上述三次离心回收的上清液，经真空浓缩直至 1 ml 以下，膜（0.22 μm）过滤后用 HPLC 测定。藏红花素的检测色谱柱：Nucleosil C18（3.9 mm × 150 mm，5 μm 粒度）；紫外可见光检测器（波长范围：190 ～ 800 nm）；检测波长：440 nm；流动相：53% 甲醛溶液；流速：0.7 ml/min，进样量：10 μl。

1.2.3 NO3-、NH4+、PO43-浓度的测定方法 NO3-浓度的测定方法见文献[10]；NH4+浓度的测定方法见文献[11]；PO43-浓度的测定方法见文献[12]。

2 结果

2.1 通气量对藏红花细胞悬浮培养的影响

鼓泡式生物反应器结构简单、剪切力较小、操作简易、不易染菌，在植物细胞培养中被较广应用。在 2.5 L 鼓泡式生物反应器中接种鲜重为 100 g 的藏红花细胞，控制不同的通气量，在 2 L M2B5 液体培养基中（22 ± 1）℃ 全时暗培养 28 d 后，细胞的生物量和藏红花素的产量如图 1所示。

图 1 通气量对鼓泡式生物反应器中藏红花细胞生长和藏红花素累积的影响

从图 1 可见，气流量对藏红花细胞的悬浮培养影响较大，在一定范围内，随着通气量的增加，细胞的生物量和藏红花素的产量也在增加。当通气量为 0.015 m3/h 时，细胞生长最快，生物量达到最高，为 8.6 g/L；藏红花素的产量也达到最高，为 0.44 g/L；与生物量相对应，细胞的增长倍数也达到最高，为 3.2 倍。若通气量继续增加，细胞的生物量和藏红花素的产量均下降，如当通气量为 0.03 m3/h时，细胞的生物量、细胞增长倍数和藏红花素产量分别降至6.1 g/L、2.3 倍和 0.32 g/L。

在植物细胞的悬浮培养过程中，通气量过高或过低均会产生不利影响。过低的通气量造成培养液中溶氧系数过低，细胞得不到充分的氧气，生长受到阻碍；另外，通气量过低，不利于细胞在反应器内循环，细胞堆积于反应器底部，得不到充分的营养物质和氧气的供应，容易褐变死亡。而气流量过大，细胞在培养液中受到的剪切力过大，严重损伤细胞膜，导致细胞溶解；同时，过量的通气量驱除了培养液中的 CO2和乙烯等对植物细胞生长和次级代谢产物合成有益的气体，从而抑制植物细胞的生长和次级代谢产物的合成[13-14]。鼓泡式生物反应器的氧传递能力一般较大，且高通气量时，因CO2的排出往往会使植物细胞生长下降而降低了气体成分的传质系数[15-16]，所以在培养藏红花细胞时，宜采用较低的通气量，以 0.015 m3/h 为宜。

2.2 通气量对蔗糖、 消耗的影响

在不同通气量下，将鲜重为 100 g 的藏红花细胞接种在 2 L M2B5 液体培养基中，（22 ± 1）℃ 全时暗培养 28 d后，培养液的蔗糖、的浓度变化见图 2。

图 2 通气量对培养液中蔗糖、浓度变化的影响

2.3 接种量对藏红花细胞悬浮培养的影响

通气量为 0.015 m3/h，在 2.5 L 鼓泡式生物反应器中按不同接种量接入藏红花细胞，在 2 L M2B5 液体培养基中（22 ± 1）℃ 全时暗培养 28 d 后，细胞生长和藏红花素合成的结果见图 3。

图 3 接种量对鼓泡生物反应器中藏红花细胞生长和藏红花素累积的影响

图 3 表明在鼓泡塔式反应器中，接种量对细胞的生物量和藏红花素的产量影响都很大。接种量过小时，细胞生长的延滞期较长，细胞生长缓慢，细胞的生物量和藏红花素的产量都很低。随着接种量的增加，细胞的生物量和藏红花素的产量也随之增加；但接种量过大，通气量较小，细胞则易堆积于反应器底部，而且氧供应不充分，供氧速率下降，细胞容易因缺氧而变褐死亡，细胞的生物量和藏红花素的产量随之下降。控制通气量为 0.015 m3/h，当接种量为 5%，细胞生长最快，培养 28 d 后增长 3.2 倍，达到 9.6 g/L，藏红花素的产量也达到最高，为 0.45 g/L。若接种量继续增加，细胞的生物量和藏红花素的产量未随之增加，细胞的增长倍数反而降低。

2.4 接种量对培养液的蔗糖、消耗的影响

通气量为 0.015 m3/h，将不同接种量的藏红花细胞接入2 L M2B5 液体培养基中，（22 ± 1）℃ 全时暗培养 28 d 后，培养液的蔗糖、的浓度变化见图 4。

图 4 接种量对培养液中蔗糖、浓度变化的影响

图 4 表明在通气量为 0.015 m3/h，接种量为 5% 时，培养 28 d 后，培养液中和蔗糖的浓度均达到最低，分别为 1213 mg/L、12.4 mg/L、18.7 mg/L和6.8 g/L，都与藏红花细胞的最大生物量（9.6 g/L）和藏红花素的最大产量（0.45 g/L）相对应。

表 1 藏红花细胞在摇瓶和生物反应器培养的比较

3 讨论

生物反应器技术是植物细胞培养生产次级代谢产物实现产业化的关键因素之一。最初植物培养生物反应器大多采用微生物反应器，由于植物细胞与微生物细胞存在很大区别，因此，必须开发和选择适于植物细胞培养的生物反应器。

与摇瓶培养相比，在生物反应器中，植物细胞次级代谢产物的合成能力难以提高，甚至某些时候合成能力丧失。通常造成这种情况的主要原因是植物细胞的个体大，细胞壁僵脆和具有大的液泡，因此在高剪切力下细胞容易被损伤和溶解；但剪切力对植物细胞的影响也有积极方面，如增加通气，保持细胞良好的混合状态和分散性，在合适的条件下可以提高细胞产率和增加次级代谢产物的产量[17]。因此需要不断优化生物反应器的种类及相关参数，既能保持细胞的分散性、增加溶解氧，又能减少剪切力副作用。藏红花细胞在摇瓶和 3 种生物反应器培养的结果比较见表 1。

表 1 表明，与摇瓶培养[8]相比较，藏红花悬浮细胞在生物反应器培养的生物量比较低，采用鼓泡塔和气升式反应器培养藏红花细胞，其藏红花产量分别是采用摇瓶培养的71.6% 和 72.3%，但采用反应器培养有利于规模化生产藏红花素。

通过分析藏红花细胞在 3 种生物反应器的培养结果可知，与导流筒气升式生物反应器[18]相比，采用鼓泡式生物反应器培养 28 d 后，藏红花的生物量和藏红花素的产量没有明显差异，但细胞的增长倍数比较高。与筛网导流筒气升式生物反应器[18]相比，采用鼓泡式生物反应器培养，藏红花的生物量和藏红花素的产量均有提高，鼓泡式生物反应器为植物细胞的生长提供了低剪切力环境，其结构简单，气体从底部通过喷嘴或气体分布器穿过培养液实现气体传递与物质交换，整个系统密闭，易于无菌操作；培养过程中无需机械能消耗，适于培养藏红花细胞生产藏红花素。

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