大鼠脑外伤后脑组织S100B蛋白的表达及其法医学意义

向建华，余彬华，雷 绫

（1.峨眉山市公安局 刑事技术室，四川 峨眉山 614200；2.乐山职业技术学院，四川 乐山 614000）

有关损伤时间推断的课题历来都是法医病理学者研究的热点，尤其是颅脑损伤时间的推断。脑挫裂伤（brain contusion，BC）是法医学上常见的原发性闭合性／开放性脑损伤，它是指在颅脑受到暴力作用后而直接造成脑组织点片状出血、水肿及坏死性变化的器质性损伤。BC后可引起多种蛋白、细胞因子的改变。本研究通过大鼠建立脑挫裂伤模型，在不同时间点对脑损伤区、损伤周边脑组织取材，并以阴性组和正常组作为对照，运用免疫组织化学方法检测蛋白的动态变化，了解S100B标记的胶质细胞对脑挫裂伤的反应，并以此来推断脑外伤后所经过的时间，探讨其发生机制及其在法医学上的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

健康、清洁的SD大鼠80只，雌雄不限，体重在250g左右，购自重庆医科大学动物实验中心。按照随机的原则将大鼠分为实验组、阴性对照组和正常对照组，其中实验组又分为损伤后4h，12h，1d，3d，5d，7d，10d共7组，每组10只，正常对照组5只，阴性对照组5只。

1.2 主要试剂

浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；鼠SP通用型免疫组化染色试剂盒（美国ZYMED公司，北京中杉金桥生物技术有限公司分装）；鼠抗S100B单克隆抗体（博士德生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

（1）大鼠脑挫裂伤模型的建立。参照高燕、孙骏谟等［1］报道的方法，实验大鼠用3%戊巴比妥钠（0.12mL／100g）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定向仪上。消毒皮肤，头皮正中切开，切口长2cm，剥离骨膜，暴露前囟和左顶骨，用牙科钻在冠状缝后2mm、矢状缝左侧2mm处钻一直径5mm圆形骨窗，保持硬脑膜完整。将撞杆置于硬膜上，用20g砝码20cm高处沿外周导管坠落，撞击撞杆从而撞击硬脑膜，致左顶叶发生脑挫裂伤。打击后切口内滴注4万单位硫酸庆大霉素4～5滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。阴性对照组仅开颅窗后用骨蜡封闭，不施加打击。正常对照组不作任何处理直接处死取材。

（2）取材及标本处理。分别于伤后相应时间断颈处死，取出全脑放入4%多聚甲醛中固定24h后，切取损伤区及其周边区组织，常规组织连续切片，切片厚3μm，作HE染色及S100B蛋白免疫组织化学染色。

（3）免疫组织化学染色。具体步骤参照北京中杉公司SP试剂盒说明进行，以PBS液作阴性对照。

（4）显微镜观察。在Olympus显微镜下观察各组常规HE切片、S100B蛋白免疫组化切片。重点观察免疫组化的着色范围、强度情况。

（5）免疫组化染色结果判定标准。S100B在哺乳动物中枢神经系统中，主要由神经胶质细胞合成和分泌，特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞；正常脑组织中仅有微量的S100B蛋白表达。如脑细胞胞浆中出现明显的棕黄色染色应判定为阳性表达。故根据神经组织内是否出现棕黄色颗粒及范围半定性划分等级为：细胞和间质无染色或微染（1级）；细胞和／或间质有染色，染色浅，呈小灶性（2级）；染色中等强度，呈斑片状（3级）；染色深，呈广泛分布（4级）。以PBS代替一抗作阴性对照的各切片均无棕黄色染色颗粒出现。

（6）图像分析。采用北京天地公司TD2000真彩色图像分析系统，对切片进行定性和半定量分析。在20×20倍镜下，按照着色色调的一定阈值分割阳性细胞，每个点取5张片，每张片取连续不重复的10个视野，平均计数阳性细胞。

1.4 统计分析

使用SPSS 11.0软件包对所得数据进行分析，所得实验数据以表示，多组间比较采用方差分析，两组间的比较采用LSD法；同一时间点的实验组与对照组比较采用配对t检验；以P＜0.05表示差异存在显著性。

2 结果

2.1 常规HE染色

脑损伤后4h，损伤区及其周围小血管和毛细血管扩张、淤血并见出血，组织水肿；神经细胞和胶质细胞肿胀，胞核着色浅，部分神经细胞核深染。伤后12h，损伤灶及其周围神经细胞皱缩、胞核固缩，尼氏体消失，胞浆呈嗜伊红色；星形胶质细胞肿胀，核固缩、碎裂或溶解，并出现炎性细胞浸润。伤后1d，损伤灶周围出现小胶质细胞。伤后3d，损伤区脑组织出现坏死，神经细胞数量减少，并可见胶质细胞增生。伤后7～10d，损伤区形成软化灶。（见图1、图2）

图1 伤后1dHE染色图片

图2 伤后3dHE染色图片

2.2 免疫组化染色镜下观察

实验组大鼠在脑损伤后4～12h，损伤区周围即可见S100B蛋白表达增多，但着色较浅。损伤后1d，损伤区周围开始出现较多的S100B蛋白表达，染色明显加深。伤后3～5d，损伤区周围有很明显的S100B蛋白表达，染色较深。随后逐渐减少，伤后10d阳性细胞数量与假手术组已无明显差别。阳性细胞主要为损伤周围星形胶质细胞。各实验组结果之间有统计学差异（P＜0.01）（见表1、图3、图4）。阴性及正常组偶见S100B蛋白阳性细胞。

表1 免疫组化染色半定量测定S100B蛋白阳性细胞数

表1 免疫组化染色半定量测定S100B蛋白阳性细胞数

注：＊与阴性对照组比较P＜0.01；△与脑挫裂伤组伤后4h、12h、1d、7d、10d比较P＜0.01。

图3 伤后1d免疫组化染色镜图片

图4 伤后3～5d免疫组化染色镜图片

大鼠脑挫裂伤后S100B蛋白阳性细胞表达时序变化见图5。

图5 大鼠脑挫裂伤后S100B蛋白阳性细胞表达时序变化

3 讨论

有研究表明，S100B蛋白不但是迄今最能反映颅脑损伤程度和预后的特异性蛋白［2］，而且在颅脑损伤后继发性脑炎性损伤中扮演着重要的角色［3］。

S100B蛋白是神经组织蛋白中的一种，为一种不含糖、脂和磷的酸性钙结合蛋白，可溶解于pH7.0的饱和硫酸铵溶液，其基因定位于染色体1q21，而且其氨基酸序列在不同种属中的一致性说明该蛋白具有重要功能。由α和β两个亚单位以反向平行的方式组成同源二聚体（S100αα，S100ββ）或异源二聚体（S100αβ），形成S100αα、S100ββ、S100αβ三种组合形式，S100αβ和 S100ββ常被统称为S100B蛋白［4］。S100B蛋白主要分布于中枢神经系统和周围神经系统的神经胶质细胞、Schwann细胞以及某些神经元、黑色素细胞、软骨细胞和脂肪细胞中。脑内生理量的S100B蛋白（3500mg／mg蛋白）主要由星形胶质细胞产生，作用于神经元及其生长环境，成为胶质细胞和神经元之间相互作用的桥梁，主要具有以下功能［5］：①胶质源性营养作用；②调节细胞的可塑性；③参与信息传递；④调节细胞代谢；⑤调节钙离子浓度；⑥其他，促进胰岛β细胞、垂体瘤细胞分泌胰岛素和催乳素；参与炎症反应等。

但高水平的S100B具有神经毒性：低浓度（1～10ng·mL－1）S100B保护培养的神经元免于谷氨酸诱导的损害［6］，但高浓度（＞10ng·mL－1）可导致星形胶质细胞和培养的神经元死亡。

本研究采用免疫组化染色法检测S100B蛋白在大鼠脑挫裂伤后脑组织的表达，结果表明：大鼠脑挫裂伤后损伤周围脑组织S100B蛋白水平在造模4～12h即开始增高，在伤后3～5d达到高峰，随后逐渐下降，到伤后10d与对照组无明显差别。引起S100B蛋白在颅脑损伤时分泌增加的机制可能有以下几个方面：①脑挫裂伤后继发炎性反应，小胶质细胞增生，分泌IL－1增多，IL－1能强烈刺激星形细胞活化和增殖，产生大量S100B蛋白，有研究表明：在体和离体实验中IL－1能显著上调S100B蛋白水平，使其升高较正常3倍以上［7］；②S100B蛋白自身液能促进星形胶质细胞的肥大和增殖产生更多的S100B蛋白，从而形成正反馈调节（Positive feed back regulation）［8］；③其他炎性因子如IL－6、TNF－α、FGF－2、5－HT 对 S100B蛋白的表达亦有促进作用；④S100B蛋白的表达增加与凋亡的关系：神经细胞和胶质细胞的凋亡的发生可能促进S100B蛋白分泌增加，但目前尚无深入探讨，需要进一步实验予以证实。

综上所述，大鼠颅脑损伤后S100B蛋白的表达具有一定的规律性，呈现出逐渐升高—高峰期—下降期的变化，其表达水平在伤后3～5d达到高峰。因此认为S100B蛋白可作为法医学颅脑损伤时间推断的一个补充指标。

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