树脂联用富集与纯化柴胡总皂苷*

王帅，孟宪生，包永睿，郭小瑞

(辽宁中医药大学药学院，大连 116600)

北柴胡(Bupleurum chinense Dc.)为伞形科柴胡属植物，是药用柴胡的主要来源之一。其性微寒，味苦，具有和表解里、疏肝、升阳举陷的功效，为中医治疗少阳证的首选药物［1］。其所含主要有效成分为柴胡皂苷，具有保肝利胆、抗炎、镇痛、抗溃疡、抗菌、抗病毒、抗细菌内毒素等作用［2-3］。采用大孔吸附树脂等技术对柴胡总皂苷类成分进行富集纯化已有文献报道，但均采用单一树脂，且洗脱率不高。笔者采用树脂联用技术纯化柴胡总皂苷，既可实现较高的洗脱率，又可保证较高的纯度。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(配有DAD、自动进样器)，Chem Station(Agilent科技有限公司)，UV-1800紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，CP225D型电子天平(德国Saritorius集团)。

1.2 试药 柴胡皂苷A、D对照品(四川维克奇生物科技有限公司，批号:090312，090114)，柴胡药材(辽宁本溪三药有限公司提供，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为 Bupleurum chinense DC.)，大孔吸附与离子交换树脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9、D900(沧州宝恩化工有限公司)，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相:乙腈(A)-水(B);洗脱梯度(0～26 min:A 30%→42%;～40 min:A 42%);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:210 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷A 2.63 mg，柴胡皂苷 D 2.26 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密量取柴胡皂苷A、D混合对照品溶液6，10，14，18，22，26，30 μL，按上述色谱条件进样测定，以峰面积的自然对数为纵坐标，柴胡皂苷A(D)量的自然对数为横坐标，绘制标准曲线，柴胡皂苷A 的回归方程分别为:Y=93.624X －37.177，r=0.999 6;柴胡皂苷 D:Y=68.734X+38.675，r=0.999 1。表明柴胡皂苷A浓度在1.578～7.890 μg、柴胡皂苷D浓度在1.356 ～6.780 μg范围内线性关系良好。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷 A 5.53 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 检测波长的选择 精密吸取柴胡皂苷A对照品溶液0.3 mL，置于10 mL具塞试管中，加甲醇至0.8 mL，加0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，70℃水浴10 min，后加入磷酸4.0 mL，70℃水浴5 min，放冷，于200～800 nm范围内进行全波长扫描。结果在541 nm处有最大吸收峰，故确定检测波长为541 nm。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL，置于 10 mL 具塞试管中，加甲醇至0.8 mL，分别精密加入0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，摇匀，于70℃反应10 min，取出，加入磷酸 4.0 mL［4］，70 ℃ 反应 5 min，取出，放冷，于541 nm处测定吸光度(A值)。以A值为纵坐标，柴胡皂苷A的浓度(C，mg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:A=12.425C －0.019 1，r=0.999 7(n=7)。表 明 柴胡 皂 苷 在 0.110 6 ～0.442 4 mg范围内线性关系良好。

2.3 柴胡总皂苷的富集与纯化

2.3.1 供试液的制备 精确称取柴胡药材粉末100 g，10 倍量 90% 乙醇(含 2% 氢氧化钾)［4］回流提取2次，第1次1.5 h，第2次1 h，过滤，浓缩，定容至250 mL量瓶中(0.4 g·mL-1)，稀盐酸溶液调至中性，备用。另取柴胡药材粉末100 g，同法提取，定容至1 000 mL量瓶中(0.1 g·mL-1)，稀盐酸溶液调至中性，备用。

2.3.2 树脂的预处理 选择经95%乙醇浸泡过夜的HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9等7种树脂，湿法上柱，用95%乙醇洗脱，控制流速，待流出液与水1∶5混合不产生浑浊后，用大量纯化水洗至无乙醇味，抽滤至干，备用［5］。

D900树脂，经3% ～5%盐酸溶液洗至流出液呈酸性，去离子水洗至中性，3% ～5%氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性，去离子水洗至中性，备用。

2.3.3 静态吸附与解吸实验(优选树脂) 准确称取树脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9各5 g，置于50 mL锥形瓶中，加入0.4 g·mL-1样品溶液30 mL。每隔10 min振摇20 s，2 h后吸取一定体积上清液［6］，HPLC法测定含量;树脂抽滤至干，边抽滤，边用水100 mL洗涤树脂，90%乙醇30 mL解吸，1 h后吸取一定体积解吸液，高效液相色谱(HPLC)法测定含量。结果见表1。饱和吸附量=［样品中皂苷含量－解吸液中皂苷含量］/树脂质量;洗脱率(%)=洗脱量/饱和吸附量×100%;终得量=(饱和吸附量－洗脱量)×树脂质量。由表1可知，NKA-9型号树脂的饱和吸附量与洗脱率均较高，皂苷的终得量最多，对柴胡皂苷的吸附及解吸性能较好，故确定NKA-9树脂为最佳选择。

2.3.4 动态吸附与解吸实验［7］

2.3.4.1 泄露曲线 准确称取处理好的NKA-9树脂5 g，湿法装于树脂柱上，上样100 mL(0.1 g·mL-1)，流速为2 BV·h-1，每10 mL接1管，共接9管，HPLC法测定含量。结果见图1。结果发现，柴胡皂苷A、D均在上样量为40 mL时出现明显泄露，故上样量宜为30 mL，即1 g树脂的药材用量为0.6 g。

2.3.4.2 洗脱醇浓度考察 准确称取处理好的NKA-9树脂5 g，湿法装于树脂柱上，上样30 mL(0.1 g·mL-1)，过柱液重新吸附一次，流速为 2 BV·h-1，5倍量(50 mL)水冲洗过后，依次用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各30 mL洗脱，分别收集各洗脱液，每10 mL收集1份，HPLC法测定各洗脱液的柴胡皂苷A、D含量，绘制洗脱曲线。其中1～3号瓶为10%乙醇洗脱液，4～6号瓶为30%乙醇洗脱液，7～9号瓶为50%乙醇洗脱液，10～12号瓶为70%乙醇洗脱液，13～15号瓶为90%乙醇洗脱液，结果见图2。由图2可知，70%乙醇几乎将全部柴胡皂苷A与D洗脱下来，故确定总皂苷洗脱醇浓度为70%乙醇。

2.3.4.3 洗脱醇用量考察 准确称取处理好的NKA-9树脂5 g，湿法装于树脂柱上，上样30 mL(0.1 g·mL-1)，过柱液重新吸附一次，流速为2 BV·h-1，先用8倍量(80 mL)水除杂，再用3倍量(30 mL)30%乙醇除杂，后用9倍量(90 mL)70%乙醇洗脱，收集30%乙醇除杂液(1～3号)及70%乙醇洗脱液(4～12号)，每10 mL收集1份，共12份，HPLC法测定各样品中柴胡皂苷A、D含量，绘制洗脱醇用量曲线。见图3。由图3可知，8倍量70%乙醇几乎将全部柴胡皂苷A、D洗脱下来。故确定洗脱除杂方案为:8倍量水、3倍量30%乙醇除杂，8倍量70%乙醇洗脱。

2.3.5 离子交换树脂 经NKA-9大孔吸附树脂纯化后的70%乙醇洗脱液，以2 BV·h-1的流速直接经过与吸附树脂等量的D900离子交换树脂脱色除杂，紫外分光光度法测定总皂苷含量，纯度达70.3%。

3 讨论

由静态吸附实验结果可知，大孔吸附树脂的孔径大小对柴胡皂苷的吸附量影响较大，而极性对其洗脱率影响较大。不同极性的 HPD300、HPD400、HPD600树脂，孔径较小，其饱和吸附量也相对较小;而其他孔径相对较大的树脂，其饱和吸附量也相对较大。同为极性的 HPD600、NKA-9树脂，其洗脱率均较高，与NKA-9具有相似大小孔径的NKA树脂，由于其非极性，故洗脱率不如NKA-9。AB-8树脂饱和吸附量最大，但洗脱率较小;HPD600洗脱率较大，但饱和吸附量并不大。综合以上两种影响因素，考虑其最终得量，故确定NKA-9树脂为最佳选择。

在对洗脱醇浓度考察时，10%与90%乙醇液中均不含所需成分，柴胡皂苷A在30%乙醇液中含量占5.32%，50%乙醇液中为 70.60%，70%乙醇液中为24.08%。柴胡皂苷 D在 30%乙醇液中含量占4.20%，50%乙醇液中为 44.46%，70%乙醇液中为51.35%。故确定总皂苷洗脱醇浓度为70%的乙醇。

在对洗脱醇用量考察时，3倍量30%乙醇洗脱液中含有柴胡皂苷A 4.26%和柴胡皂苷D 3.73%;6倍量70%乙醇可将94.01%柴胡皂苷A、88.41%柴胡皂苷D洗脱下来，7倍量70%乙醇可将95.18%柴胡皂苷A、93.06%柴胡皂苷D洗脱下来，而8倍量70%乙醇可将95.74%柴胡皂苷A、96.27%柴胡皂苷D洗脱下来。故确定采用8倍量70%乙醇洗脱，洗脱率＞95%。

在醇溶液的情况下直接上柱脱色是D900树脂的优点，既省略一些不必要的工序，又可减少有效成分的损失。经NKA-9纯化后的样品，再经D900离子交换树脂脱色后，其纯度达70.3%。

［1］肖功胜，杨云，孙维英，等.柴胡有效成分提取工艺的研究［J］.时珍国医国药，2008，19(8):1829.

［2］刘永春，丛培臣.柴胡的化学成分及药理作用研究概况［J］.黑龙江医药，2006，19(3):216 －218.

［3］金顺姬.柴胡的药理作用及临床应用［J］.现代医药卫生，2009，25(7):1074 －1075.

［4］王鹏，王玉生，刘斌.不同产地柴胡中总皂苷及柴胡皂苷A 含量测定［J］.中国药物与临床，2008，8(3):228.

［5］陈龙浩，邹江冰，蒋琳兰.西番莲叶中总黄酮的大孔树脂纯化工艺研究［J］.医药导报，2010，29(1):85 －87.

［6］马轶，孟宪生，包永睿.大孔吸附树脂对淫羊藿中总黄酮及淫羊藿苷吸附纯化的研究［J］.亚太传统医药，2009，5(9):48－50.

［7］刘雄.大孔吸附树脂富集纯化柴胡总皂苷的研究［J］.分析测试技术与仪器，2007，13(1):22 －24.