SLC26A4基因突变在耳聋疾病中的作用*

柴永川 综述 杨涛 吴皓 审校

研究表明，大前庭水管综合征(enlargement of vestibular aqueduct,EVA)和Pendred综合征(pendrend syndrome,PS)的发病与SLC26A4基因密切相关。 SLC26A4基因最先由Everett等[1]在一个PS家系中定位克隆，并被命名为PDS基因。后续研究发现该基因突变也可引起非综合征型聋(DFNB4)[2]。由于PDS基因与溶质蛋白家族SLC26其他成员的结构和功能类似，故PDS基因又重新命名为SLC26A4基因(solute carrier family 26,member 4,SLC26A4)。现在认为EVA/PS是与SLC26A4有关的同一种遗传病的两种不同的疾病表现[3]。

1 SLC26A4基因的分子生物学基础

2 SLC26A4基因的筛查研究

2.1SLC26A4基因突变谱及突变类型 对EVA/PS患者SLC26A4基因的筛查研究已广泛开展。SLC26A4基因突变谱很广，截止到2010年1月，已有超过170种突变被报道(www.healthcare.uiowa.edu/labs/pendredandbor)，除分布于SLC26A4的编码区和剪接位点外，位于非编码区外显子1，结合转录调节因子FOXI1的启动子序列中也发现有突变[8]。SLC26A4基因突变所导致的蛋白质改变可遍及整个蛋白质长度，在其跨膜结构的膜内段及膜外段都有不均等的分布。突变类型也多种多样，包括移码突变、错义突变、无义突变以及剪接位点突变等。

2.2SLC26A4基因的突变热点 SLC26A4基因存在着热点突变，但表现出明显的地域和种族差异性。王秋菊等[9]于2007年通过对我国107个EVA耳聋家系及相应对照人群的研究分析，揭示出中国EVA耳聋患者所特有的SLC26A4基因突变谱，其研究显示高达97.9%的患者至少携带一个SLC26A4突变，并且88.4%的患者是双等位基因突变，这些患者共出现了40种突变，包括25种新的突变，其中c.919-2A>G突变是中国人群中最常见的突变方式，占总突变数的57.63%，其次是p.H723R，占9.04%，而且在Exon7、8、10、19、15以及17中的突变之和占了总突变数的84.2%。这一特点对于临床实践具有重要的提示作用，即对于EVA/PS患者，只要进行SLC26A4基因的突变热点检测，就可以对大部分患者作出明确的分子诊断，极大的提高了基因筛查的效率。2008年戴朴等[10]针对中国人群SLC26A4基因高发突变c.919-2A>G在我国27个地区3 271名中重度感音神经性聋患者中进行了筛查，详细阐述了此突变在我国各民族地区的分布及其代表性和特异性。2009年戴朴等[11]利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术和直接DNA测序的方法，对中国和美国EVS/PS患者进行SLC26A4基因检测，揭示了中美患者不同的SLC26A4突变谱，并显示出两国EVA耳聋患者SLC26A4基因突变的高诊断检出率，该研究显示：在55例中国EVA耳聋患者中，有52例(95%)患者SLC26A4基因检测出突变，其中36例(76%)患者具有双等位基因突变，并且在SLC26A4基因突变图谱中c.919-2A>G(73%)和 p.H723R(14%)占了总突变的87%；与中国人群相比，美国患者中SLC26A4基因突变检出率相对较低，为20%(50患者中检出10例突变：3例为双等位基因突变，7例为单等位基因突变)，并且p.L236P和p.T416P等是该人群中最常见的突变类型。

在东亚的蒙古人种中，日本和韩国SLC26A4基因的主要突变方式为p.H723R。在日本p.H723R占SLC26A4突变的53%，而与日本有所不同的是韩国c.919-2A>G突变也比较普遍[12, 13]。在欧美的高加索人种中，最常见的三个突变是p.L236P(16%)、p.T416P(15%)和IVS8+1G>A(14%)，这三者突变之和约占总突变数一半，而在东亚人群中这三种突变方式很少见[14]。

2.3SLC26A4非双等位基因突变 在EVA/PS患者中，SLC26A4基因存在着大量的非双等位基因突变，而且在不同国家中非等位基因突变的比例存在差异。据不同文献报道，北美和欧洲的比例最高，占EVA患者总数的67%～85%[8, 15～17]；东亚的日本和韩国分别为53%和19%[12, 13]；我国为11.6%左右[9]。在一些无SLC26A4双等位基因突变的EVA耳聋的小型家系中，通过单倍体型分析发现：子代中SLC26A4基因型相同的兄弟姐妹，有的具有EVA表型，有的则完全正常，并且在一对SLC26A4等位基因完全相同但EVA表型却完全不同的姐妹中，发现有其他相关基因的区别，这些与单基因常染色体隐性遗传方式不符[8, 18]。上述事实表明除SLC26A4基因外，还存在着其他基因和/或环境因素参与了EVA/PS病因的构成。

3 SLC26A4基因的功能研究

3.1SLC26A4基因正常功能的研究 SLC26A4表达于甲状腺、肾脏及内耳。和其离子转运功能相对应，Pendrin在内耳中表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊、血管纹纺锤形细胞、耳蜗外沟和螺旋突起[19, 20]，这些部位都与维持内淋巴液离子环境的动态平衡有着密切联系。因此推测SLC26A4基因的突变可能导致内淋巴液离子环境失衡，进而导致耳聋，这一点已经在近期研究中通过对EVA动物模型SLC26A4基因敲除小鼠的内淋巴液离子成分分析被初步证实[21]。但是有关SLC26A4基因突变致聋的具体分子机制目前尚不清楚。在甲状腺中，SLC26A4基因表达于甲状腺滤泡细胞的顶端膜上，该处Pendrin的功能与Cl-/I-的转运有关[6]。具体机制是甲状腺滤泡细胞基底膜上有Na+-I-同向转运体(sodium iodide symporter, NIS)表达，通过其转运作用I-从血液循环中被转运到甲状腺滤泡细胞中，然后经位于甲状腺滤泡上皮顶膜上的Pendrin转运到胶质中储存。这种有效的I-的捕获机制促使位于甲状腺球蛋白络氨酸残基上的碘离子氧化和有机化，从而经酶耦合形成甲状腺激素。相关研究[6, 22]推测：SLC26A4基因突变使得Pendrin失去Cl-/I-的离子转运功能是导致并发性甲状腺肿的原因，从而表现为Pendred综合症。但是临床同时发现，相同突变类型在不同的个体中其甲状腺表型变化极大，导致这一现象的原因有待于深入研究。

3.2SLC26A4基因异常功能的研究 在SLC26A4基因的突变类型中，移码突变、无义突变及剪接位点突变的致病性是公认的。对于单个氨基酸改变的错义突变，若符合以下两个原则则普遍被认为具有高致病性可能：①与不同物种的基因序列相比较，证实被替代的氨基酸是高度保守的；②正常对照人群中相对应的错义突变发生率极低。然而这些标准只能提供突变致病性的间接证据，对于一些罕见的基因型多态并不能做出有效的推测，而且个别功能性致病突变也可能发生在非保守氨基酸上，因此在这种情况下要明确突变如何影响基因的功能只能借助于功能研究。

3.2.1SLC26A4基因突变致Pendrin蛋白定位异常 Rotman-Pikielny等[23]在活体细胞中利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记野生型(wild-type,WT)及三种高加索人群中最常见的突变型Pendrin蛋白(p.L236P、P.T416P、p.G384E)在细胞内的运输，共定位研究显示GFP-WT Pendrin能正确定位到细胞膜上，而三种Pendrin突变体都滞留在内质网中。和隐性遗传模式相对应，突变Pendrin不会抑制野生型Pendrin或者其他膜蛋白(如病毒膜蛋白VSVGtsO45)到细胞膜上的运输，从而可以解释携带有单个致病性突变的个体不会出现相关表型的原因。同年Taylor等[22]研究了9个错义突变的Pendrin突变体在细胞上的定位，不仅发现有完全滞留在内质网中的突变体，而且发现有部分滞留内质网、部分定位到细胞膜以及完全正确定位到细胞膜上的突变体。对于突变体蛋白为什么不能运输到细胞膜上，一般认为是突变引起了肽链的异常折叠，从而干扰了蛋白质的成熟及其到细胞膜上的运输，这种突变机制在很多跨膜转运蛋白中都有报道，而且这种突变都是致病性的[24]。对于滞留在内质网中的Pendrin突变体在EVA/PS疾病中的致病性容易理解，但对于能正常定位到细胞膜或部分定位到细胞膜的Pendrin突变体的致病性则需进一步的研究。

3.2.2突变致Pendrin蛋白介导的离子转运异常 突变体蛋白正常运输到细胞膜上后，其离子转运功能障碍也会引起疾病的发生。Taylor等[22]研究了Pendrin突变体在细胞中转运碘离子的功能，结果显示相当量的突变体与野生型的Pendrin存在着明显的差异。他们首先使细胞转染Na+/I-离子同向转运系统(NIS)，这样NIS便可以从细胞外吸收足够的I-，从而通过I-的外流实验分析这些突变体对I-转运功能的影响。结果显示，仅转染NIS的细胞I-的流出率很低，而共转染了NIS和野生型SLC26A4的细胞在1分钟时测量的I-流出率显著提高。在共转染了NIS和能正常定位到细胞膜上的Pendrin突变体(p.L117F,p.G209V)以及部分能定位到细胞膜上的Pendrin突变体(p.Y556C,p.G672E)的细胞中，只有p.L117F的细胞I-流出率与野生型相似，p.G209V有部分I-的流出功能，但是其流出率明显降低，其余突变体的功能则与共转染了NIS和完全不能定位到细胞膜的突变体(p.G102R、p.V138F、p.L236P、p.T410M、p.Q446R)的细胞一样，完全丧失了I-的流出能力。这一结论表明，定位异常的Pendrin可完全丧失I-的转运能力，即使能正常定位到细胞膜的Pendrin突变体其转运I-的能力也可能有所下降，从而具有致病性。

2008年Pera等[25]通过功能实验得出结论，用于预测SLC26A4错义突变后离子转运功能降低的两个标准：①突变在对照人群中的低发生率；②突变导致了保守氨基酸的替代—有时是不可靠的。有些符合上述两个标准的突变其离子转运功能正常，而在正常对照人群中发现的某些被认为是多态的基因改变，其离子转运功能却明显降低。同时通过10个错义突变的功能试验一致性证实：在蛋白质水平上脯氨酸或者带电氨基酸的增减对Pendrin的功能是有害的，其一个有力证据[25]是p.V88I和p. L597 S突变后Pendrin突变体的离子转运功能正常，但当p.V88I和p. L597S变成p.V88P和p. L597P后Pendrin的离子转运功能则完全损失。这一结论对于预测突变的致病性有重要的帮助。但需要着重指出的是，当错义突变没有增减带电氨基酸或者脯氨酸时，这种改变在功能上既可能是有害的也可能是无害的，若要明确其致病性则需要功能验证。

4 SLC26A4基因与其他基因之间的联系

4.1SLC26A4与FOXI1基因 2007年由Yang等[8]首先在EVA/PS患者中证实了SLC26A4与FOXI1基因之间的致病相关性，他们在372例SLC26A4无双等位基因突变的EVA/PS患者中发现6例患者在转录调控基因FOXI1中具有突变，9例患者在SLC26A4基因的启动子中具有c.-103T>C突变，其中有一例患者的突变类型是双基因的复合杂合突变，即分别携带有SLC26A4和FOXI1单个等位基因突变；通过对启动子中c.-103T>C的突变以及FOXI1基因本身突变的功能研究证实，FOXI1作为转录调控基因与SLC26A4的启动子结合后，对SLC26A4的转录具有激活作用。当SLC26A4转录调控基因FOXI1或启动子的突变联合SLC26A4的致病突变时，将引起EVA/PS疾病的发生，这种双基因的遗传模式在基因敲除的小鼠模型也得到了有力证实[8]。

4.2SLC26A4基因与KCNJ10基因 2009年Yang等[27]发现内向整流钾离子通道KCNJ10是EVA/PS致病因子中另一个重要的遗传因素。他们对89例SLC26A4只有单等位基因突变的EVA/PS患者进行KCNJ10基因序列筛查时发现2例患者具有KCNJ10单等位基因的突变。在利用电压钳技术对这两个突变产物进行电生理检测时显示：这两个突变产物与野生型KCNJ10的产物相比，钾离子通道的导电活性明显降低，而此钾离子电导活性是维持内耳静息电位必不可少的关键因素，对听觉功能至关重要[28, 29]。在小鼠模型中Yang等[27]还发现SLC26A4突变导致了KCNJ10基因在耳蜗血管纹处表达明显减少，表明这两个基因之间存在着病理上的联系；他们推测，SLC26A4突变后将导致内淋巴液离子环境的改变，局部环境的改变选择性地降低了KCNJ10在血管纹处的表达，因而失去了维持内耳静息电位的基础，这可能是耳聋发生的直接因素。不过SLC26A4突变如何具体导致KCNJ10基因表达减少的分子机制目前还不清楚。

5 结语

综上所述，SLC26A4基因是引起EVA/PS的主要隐性遗传基因，但不是EVA/PS病因的唯一基因因素；FOXI1及KCNJ10基因突变也可能参与EVA/PS的发病；目前寻找更多的EVA/PS发病的基因及环境因素是研究的一大热点。SLC26A4基因筛查发现，其突变谱和突变类型复杂多样，不同种族及人群中的突变各具特点。中国是一个地域广阔的多民族国家，要明确各个地区及民族的SLC26A4的突变特点，还需要更加广泛和深入的筛查研究。SLC26A4基因所编码的Pendrin蛋白结构复杂，其准确的拓扑结构信息对于研究Pendrin的功能和预测错义突变的致病性非常重要，此领域的研究亟待加强。

SLC26A4在不同组织中表达，而在不同组织所发挥的离子转运功能不同，其在各组织中的具体作用还不是十分明确。SLC26A4基因异常功能研究显示，突变后的基因表达产物有以下几种可能：①突变体蛋白在细胞内运输发生障碍而不能正确定位到细胞膜上；②能正确定位到细胞膜上但离子转运功能发生严重障碍；③能正确定位到细胞膜上但离子转运功能发生部分障碍(低功能突变)。此外，SLC26A4基因与其他基因在EVA/PS的疾病的发生机制中存在着重要联系，EVA/PS是一种受多基因影响的复杂型遗传性疾病。部分SLC26A4基因突变可能不影响突变蛋白本身的细胞内定位和离子转运功能，但可能干扰其与其它EVA/PS相关基因的相互结合与作用。有关这方面分子机制的研究将对EVA/PS耳聋的分子诊断与基因治疗具有重要的意义。

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