MMP-9和EGFR在中耳胆脂瘤中的表达及作用

周宏 周维镕 徐普庆

近年来国内外学者对中耳胆脂瘤引起的骨质破坏机制进行了大量研究,并提出许多理论，如: 胆脂瘤的机械压力作用、慢性感染引起骨髓炎、pH值改变、破骨细胞的骨溶解作用、酶类介导的骨吸收作用、细胞因子参与的骨质破坏作用等[1]，尽管中耳胆脂瘤骨质破坏的确切病因尚未清楚,但关于中耳胆脂瘤骨质破坏吸收的机制主要有两种学说[2], 即“机械压迫学说”和“生物化学学说”。前者认为中耳胆脂瘤骨吸收主要是由于中耳胆脂瘤上皮细胞的过度增殖和凋亡引发角化上皮脱落加速，使胆脂瘤不断增大，通过对周围骨质的机械压迫而使骨质吸收和破坏；研究发现[3]中耳胆脂瘤上皮细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白的高比例存在，且不同胆脂瘤上皮以及同一胆脂瘤上皮的不同区域具有表达的不均一性，提示EGFR与不同的增殖活性有关。而后者指出在中耳胆脂瘤组织中存在大量酶, 它们对骨质的破坏起着重要作用；有实验[4]表明基质金属蛋白酶-9(human middle ear cholesteatoma，MMP-9)与中耳胆脂瘤的骨质破坏作用关系密切,是中耳胆脂瘤致骨质破坏的重要物质。因此，本研究拟通过检测MMP-9、EGFR在中耳胆脂瘤中的分布及表达水平, 观察二者与骨质破坏程度的相互关系, 进一步探讨中耳胆脂瘤骨质破坏的可能机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 中耳胆脂瘤组织和耳道深部正常皮肤均取自2008～2009年南通大学附属医院耳鼻咽喉-头颈外科收治的中耳胆脂瘤患者的手术标本, 共22例，年龄5～65岁, 男女之比为13∶9。每例均取一块典型的中耳胆脂瘤上皮组织，并取一块外耳道深部正常皮肤作对照。中耳肉芽组织取自2008～2009年南通大学附属医院耳鼻咽喉-头颈外科收治的伴肉芽增生的慢性化脓性中耳炎患者的手术标本，共10例, 年龄13～67岁,男女之比为3∶7。标本于手术中取出后经有经验的病理科医生检查证实诊断无误。

1.2研究方法

1.2.1标本染色 采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，ELIVISON二步法进行染色。标本经4%福尔马林固定、LEICA自动脱水、透明、浸蜡处理，包埋成蜡块，切片厚度4～5 μm，将载玻片排列整齐烘干, 经POLY-L防脱片处理。置于温度67 ℃烘箱中烘片2小时，脱蜡至水，PBS冲洗，分别按照MMP-9和EGFR一抗的要求进行预处理。处理完毕后放入自动免疫组化染色仪中，编程，从自动免疫组化染色仪中取出已染色完毕的切片，苏木素复染，0.1%HCl分化, 自来水冲洗, 蓝化, 切片经梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明,中性树胶封固。

1.2.2结果判定

1.2.2.1MMP-9和EGFR的分布及表达水平判定 中耳胆脂瘤上皮组织和中耳肉芽组织、耳道深部正常皮肤的细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)、中等阳性(棕色)、强阳性(棕褐色)。采用多媒体彩色免疫组化病理图像分析系统对染色结果进行定量分析。每张切片于200倍视野下随机计数4个视野，计算阳性表达率及平均光密度(A值)，取其均值为该标本测量结果。

1.2.2.2中耳胆脂瘤侵袭能力评定[5]术中观察中耳胆脂瘤病变范围及听小骨破坏情况, 无明显听小骨破坏者记为(+), 破坏砧骨者记为(++), 破坏砧骨和锤骨者记为(+++ ), 破坏砧骨、锤骨、乳突天盖和/或乙状窦骨板者记为(++++)。

1.3统计学方法 应用计算机统计软件Stata 7.0进行数据处理和分析,其中MMP-9或EGFR的各组标本之间及两者之间差异性检验采用单因素方差分析，两者之间相关性分析采用Pearson Correlation法,显著性水准α= 0.05。

2 结果

2.1MMP-9和EGFR阳性细胞的表达 18例中耳胆脂瘤上皮、4例中耳肉芽组织和10例外耳道上皮组织中，MMP-9和EGFR呈阳性染色，在中耳胆脂瘤上皮染色最强, 多为中等至强阳性表达, 上皮组织各层细胞均有表达, 基底膜染色较强, 两者的表达分布相同, 但从表达程度上看, MMP-9的表达稍强于EGFR(图1～3)。在中耳肉芽组织及外耳道皮肤中MMP-9和EGFR均有不同程度的表达, 染色多为弱阳性。统计分析显示各组之间差异有统计学意义(P<0.05)，中耳胆脂瘤组织中MMP-9和EGFR的阳性表达之间差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2MMP-9和EGFR在中耳胆脂瘤中的表达与骨质破坏的关系 本组中耳胆脂瘤侵袭能力评定(+)1例,(++)4例,(+++)10例，(++++)7例。 MMP-9和EGFR在(+-++)、(+++)、(++++)各级中耳胆脂瘤的平均A值(M)分别为0.24、0.26、0. 30和0.22、0.24、0.27,各级的平均A值之间差异有统计学意义(均为P<0.05), 进一步作两两比较发现不同级别之间差异均有统计学意义(两两组间比较均为P<0.05)。

表1 中耳胆脂瘤组织、肉芽组织、外耳道深部正常皮肤中MMP-9和EGFR的阳性表达

注：*与同一标本中MMP-9的表达相比较，P<0.05

图1 中耳胆脂瘤上皮MMP-9阳性表达(免疫组化染色×200) 全层细胞强阳性图2 中耳胆脂瘤上皮EGFR阳性表达(免疫组化染色×200) 全层细胞强阳性图3 中耳胆脂瘤上皮MMP-9、EGFR阳性表达(免疫组化染色×200) 全层细胞强阴性

2.3MMP-9和EGFR表达的相互关系 MMP-9和EGFR在中耳胆脂瘤中表达均为阳性15例,均为阴性3例, MMP-9和EGFR之间有相关性(r=0.488,P<0.05); 经Pearson相关分析显示, 15例MMP-9、EGFR表达均阳性的中耳胆脂瘤中, 二者的平均A值之间存在相关性(P<0.05) 。

3 讨论

中耳胆脂瘤形成的确切机制目前尚不清楚, 其危害主要决定于其对周围骨质的破坏程度, 因此了解其骨质破坏的发生机制对于阻断疾病的发展及减少并发症的发生、防止复发是至关重要的。MMP-9是MMPs分子量最大的酶，是引起基底膜及细胞外基质降解的重要成分，它以酶原形式分泌, 被激活后形成Ⅳ型胶原酶, 直接参与生理和病理性溶骨过程[6]。研究表明, 表皮生长因子(EGF)能促进成纤维细胞、血管内皮细胞增生, 增强单核巨噬细胞的趋化和吞噬功能。增多的成纤维细胞在TNF -α等作用下又可合成和分泌多种生物活性酶, 如胶原酶、前列腺素E2等，这些介质可引起组织脱钙、骨质和骨蛋白的溶解, 导致骨质吸收[7]。

本实验结果显示: MMP-9和EGFR在中耳胆脂瘤中的表达阳性率及平均A值明显高于中耳肉芽组织、外耳道深部正常皮肤组织,且二者的表达与骨质的破坏程度相关，破坏范围越广，二者在中耳胆脂瘤中的表达越明显。说明MMP-9和EGFR与中耳胆脂瘤的骨质破坏作用关系密切, 它们是中耳胆脂瘤骨质破坏中的重要物质，与李咏玲[8]的观点一致。本研究还发现，MMP-9在中耳胆脂瘤中的表达阳性率及平均A值高于EGFR，推测MMP-9在胆脂瘤的骨质破坏作用中可能起了更主要的作用，MMP-9可能直接作用于周围组织及骨基质, 起到骨质破坏作用。另外，本实验结果还表明两种蛋白阳性表达率之间及平均A值之间有相关性, 后者可能是前者产生的诱导因素,提示MMP-9可在炎症刺激下,由胆脂瘤上皮组织中的细胞分泌的EGFR等细胞因子诱导产生[2,9]。二者之间的相互作用进一步加重骨质破坏,共同促进中耳胆脂瘤的发展, 在胆脂瘤的骨质破坏中起着关键的作用。

4 参考文献

1 林刃舆，迟放鲁.中耳胆脂瘤形成机理的研究进展[J]. 国外医学耳鼻咽喉科学分册，2001，25: 153、212.

2 徐志文, 倪海峰. 胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机制及手术治疗[J]. 国外医学耳鼻咽喉科学分册, 2005，29: 251.

3 李厚恩, 江平, 汪磊. 胆脂瘤上皮过度增殖行为的免疫组化研究[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志, 2002，37:118.

4 叶放蕾,朱丽雅,崔艳红，等. MMP-9在中耳胆脂瘤中的表达和意义[J].听力学及言语疾病杂志,2008，16: 412.

5 江超武，展鸿谋,王文惠，等. 转化生长因子β1和即刻早期基因及p27在中耳胆脂瘤上皮中的表达[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志，2004,39:211.

6 Fang J, Shing Y, Wiederschain D, et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 97:3 884.

7 孙文忠,徐志文,唐安洲，等.胆脂瘤上皮细胞增殖与凋亡的信息传导及基因调控[J].国外医学耳鼻咽喉科学分册, 2005,29:131.

8 李咏玲.胆脂瘤型中耳炎的骨质破坏机制研究进展[J].医学综述，2008，14:1 054.

9 王辉兵，徐志文，唐安洲.胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机制的组织酶学研究[J].耳鼻咽喉头颈外科，2002，9：63.