液相色谱串联质谱法测定养殖水体中孔雀石绿及其代谢物

徐彦辉 顾 亮 蒋俊树 丁 磊

(国家农副加工食品质量监督检验中心，安徽国家农业标准化与监测中心，合肥 230051)

孔雀石绿(MG)为三苯甲烷类工业染料，同时还是一种有效的杀灭霉菌的染料类药物，对真菌和寄生虫有较好的杀灭效果，在水产业得到了广泛应用。孔雀石绿是3个芳香胺的聚合物，存在潜在致癌、致畸、致突变作用。自1980年发现孔雀石绿具有潜在的致癌性, 美国、日本以及英国等许多国家已禁止其用于水产养殖业。中华人民共和国农业行业标准NY5071-2002《无公害食品渔用药物使用准则》中已将孔雀石绿列为禁用药物。但是由于孔雀石绿效高价廉、管理力度不够、替代品少等原因，使得不少渔民还在小范围使用，这不可避免地带来其在水产品中的残留问题和环境污染问题[1]。有文献报道孔雀石绿进入养殖水体后，除了进入鱼体还会有一部分残留在水中。另外，孔雀石绿作为工业染料而产生的废水有可能通过相关渠道进入养殖水体系，污染水体。近年来我国因药物残留，出口的动物源性食品禁运现象经常发生。孔雀石绿作为一种禁用药物，需要开发出一种灵敏可靠的检测方法来监控其使用情况，这不仅局限于水产品本身，对养殖环境中的孔雀石绿的监控同样极其重要。总之，随着对水产品质量安全重视，对有害有毒物质的监控越来越多，要求也越来越严格，无论是从对孔雀石绿在水产品中使用的监控还是对养殖水体间接污染物的监测，都有必要建立一种水产养殖环境中孔雀石绿的检测方法。

目前国内有关孔雀石绿的研究报道主要集中在水产品中，对养殖水体中的残留检测报道较少。笔者建立了一种简便、高效、准确，适用于检测水样中痕量孔雀石绿及其代谢物的方法，为水产养殖环境提供可行的监测手段，同时可为水体中孔雀石绿检测标准的制定提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪：6410 Triple Quad LC/MS型，美国安捷伦公司；

离心机： Z-323 K型，德国哈默公司；

超声波清洗器：KQ5200 DE型，昆山市超声仪器有限公司；

混匀器： IKA MS 3basic，德国IKA公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色谱纯，美国TEDIA公司；

显性孔雀石绿(MG)和隐性孔雀石绿(LMG)标准储备液：1 mg/L，用乙腈配制，根据需要用流动相将混合中间标准溶液稀释成适合浓度的混合标准工作溶液，现配现用；

试验用水为美国Milli-Q去离子水发生器制备的高纯水。

1.2 样品前处理

准确量取20 mL养殖水样于50 mL具塞离心管中，以5 000 r/min离心5 min，除去部分杂质，将上清液转移至另一50 mL具塞离心管中用乙酸调节至pH (3±0.2)，将酸化后的水样全部转移至已活化的PCX (60 mg,3 mL)固相萃取柱(使用前用3 mL乙腈，3 mL 2%甲酸水溶液活化)，控制流速不超过0.5 mL/min，将上清液全部过柱，依次用3 mL 2%甲酸水溶液淋洗、3 mL 水淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽干，用3 mL乙酸乙酯-甲醇-氨水(体积比为50∶45∶5)洗脱，收集洗脱液于50℃水浴中氮气吹干，准确加入1 mL流动相，涡旋混匀30 s后，经0.22 μm滤膜后供仪器检测。

1.3 仪器分析条件

(1)液相色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm)；柱温：35℃；流速：0.30 mL/min；进样量：5 μL；流动相：5 mmol/L乙酸铵-乙腈(体积比3∶1)，等度洗脱。

(2)质谱分析条件

离子源：电喷雾离子源(ESI+)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；雾化器压力：276 kPa (40 Psi)；毛细管电压：3 500 V；碰撞电压以及相应的定性离子对、定量离子对、保留时间及碰撞能量见表1。

表1 多反应监测(MRM)条件

2 结果与讨论

实验研究对象为养殖水样，成分相对简单，油脂、色素含量较少，因此实验省去了相关国家标准中先使用中性氧化铝除脂步骤，而选择了将养殖水样离心后采用固相萃取方法，富集水样中的孔雀石绿供色谱分析。为了选择合适的固相萃取条件，要分析研究对象的相关性质。孔雀石绿在水体中有显性孔雀石绿和隐性孔雀石绿两种存在形式。显性孔雀石绿为极性物质，易溶于水，在水体中多以阳离子形式存在，而隐性孔雀石绿极性较弱，易溶于有机溶剂[2]。结合目标物有不同的极性,实验选择了混合阳离子固相萃取柱(PCX)，它兼有阳离子交换和反相萃取性质，适合本实验中目标物的富集分析。

孔雀石绿对光、热和氧气较敏感，易发生去甲基化和氧化降解，且孔雀石绿(pKa=6.9)分子结构中有两个氨基，在酸性条件下易形成阳离子，结合固相萃取条件的优化可知pH值在实验中是关键因素，影响到富集和洗脱的效果。因此实验重点将pH值对实验的影响进行了研究探讨。

2.1 不同酸性条件下的回收率

孔雀石绿的pKa=6.9，根据阳离子固相萃取条件的选择，为了保证上样时孔雀石绿带上正电荷，理论上pH值要小于pKa两个单位以上[3]。试验比较不同pH值为3、4、5、6.7条件下孔雀石绿的回收率。从试验结果可知，随pH值的增大，孔雀石绿的回收率降低，这可能是孔雀石绿在不同酸性条件下形成阳离子的能力差异影响到了固相萃取效果。实验最终选择了使用乙酸调节养殖水样至pH 3，在此酸性条件下孔雀石绿的回收率最高。

2.2 洗脱溶剂的选择

固相萃取条件优化过程中，洗脱液的选择至关重要。同样根据阳离子固相萃取条件的选择，为了保证洗脱时中和孔雀石绿所带电荷，理论上pH值要大于pKa两个单位。在参考相关文献[4,5]的基础上，首先选择了氨水甲醇作为洗脱液，研究发现不同浓度(1%、2%、3%、4%、5%)的氨水甲醇溶液的回收率不高，因此又对洗脱液进行了优化，研究发现加入一定量的乙酸乙酯后，孔雀石绿的回收率达到了70%以上。对不同浓度的乙酸乙酯-甲醇-氨水(体积比50∶49∶1、50∶48∶2、50∶47∶3、50∶46∶4、50∶45∶5)的回收试验表明，乙酸乙酯-甲醇-氨水的体积比为50∶45∶5时回收率最高。

2.3 仪器条件的选择

在LC-MS/MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的。为了使每个组分都得到分离和鉴定，以获得最大的灵敏度，必须设置合适的色质分析条件，特别是质谱条件。

色谱条件包括色谱柱类型、流动相组成、流动相大小、柱温等。质谱条件包括离子源、离子化模式、离子源温度、雾化气流量、质量扫描范围、定量检测模式等，这些都要根据样品情况进行设定，优化的仪器分析条件见1.3。

2.4 线性关系与检出限

在优化的测定条件下，配制系列不同浓度的混合标准溶液进行测定，以各组分定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表2。

表2 显性和隐性孔雀石绿样品的检出限和线性关系

由表2可见，在0.5～50 μg/L浓度范围内，MG、LMG质量浓度和定量离子峰面积呈良好的线性关系。MG和LMG的仪器检出限均为0.5 μg/L。

2.5 回收率与精密度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法，分别对2种不同水样中孔雀石绿(MG和LMG)进行 3个水平的添加回收试验，每个水平进行 6次重复试验，测定结果的相对标准偏差为1.9%～9.6%，回收率为71.5%～88.0%，试验结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果 (n=6)

3 结语

建立了液相色谱-串联质谱法测定养殖水样中显性孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量的方法。该法具有快速、灵敏、准确和操作简单的特点，各项技术指标均满足国内外对孔雀石绿残留检测标准的要求。

[1] 张彤晴，杨洪生，林海，等.高效液相色谱法测定养殖水体中孔雀石绿和无色孔雀石绿[J].水产学报, 2007,5(31):609-703.

[2] Kamila Mitrowska, Andrzej Posyniak, Jan Zmudzki. Determination of malachite green and leucmalachite green residues in water using liquid chromatography with visible and fluorescence detection and confirmation by tandem mass spcetrometry[J]. Journal of Chromatography A,2008,1 207(1):94-100.

[3] safark I, Safarikova M. Detection of low concentrations of malachite green and crystal violet in water[J]. Water research, 2008,36:196-200.