高效液相色谱法同时测定食用油脂和膨化食品中的3种抗氧化剂

赵质创 郑晓冰 朱 虹

(汕头市质量计量监督检测所，汕头 515041)

丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)作为油脂类抗氧化剂而广泛应用于食用油脂、膨化食品中。我国《食品添加剂使用卫生标准》[1]中明确规定了上述3种抗氧化剂在食品中的限量标准，有些国家则不允许在食品中使用TBHQ。因此建立快速、同时检测抗氧化剂的方法具有是重大意义。

目前，关于测定食品中抗氧化剂的方法研究很多，除了繁琐的紫外分光光度法和薄层层析法外，多采用气相、液相色谱法[2-7]，而3种抗氧化剂同时测定的方法不多，且大多数前处理要经过萃取、浓缩等步骤，操作繁琐，导致被测组分在前处理过程损失较大，回收率低。笔者采用HPLC-DAD对食品中BHA、BHT和TBHQ进行同时测定，建立了食用油脂和膨化食品中对这3种抗氧化剂的快速准确检测方法，满足实际应用要求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配二极管阵列检测器(DAD)，美国安捷伦公司；

漩涡振荡器：美国基因有限公司；

高速离心机：上海安亭科学仪器厂；

超声波水浴器：上海科导超声仪器有限公司；

有机相过滤头：13 mm×0.45 μm，上海安谱科学仪器有限公司；

甲醇：色谱纯；

BHA、BHT、TBHQ标准品：纯度分别为99.8%、99.5%、99.7%，德国Dr Ehrenstorfer 公司；

中性氧化铝：美国安捷伦公司；

混合标准储备液：分别称取BHA、BHT、TBHQ标准样品各100 mg于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解后并定容至刻度，配制成浓度均为1 mg/mL的混合标准储备液，贮存于0～4℃冰箱中。

1.2 实验方法

(1)色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×46 mm，5 μm)；流动相流速：1.0 mL/min；柱温40℃；进样量：10 μL。

设置两种配比的流动相进行试验：(1)甲醇- 0.1%甲酸(体积比为12∶88)；(2)甲醇- 0.1%甲酸梯度淋洗，洗脱条件见表1。

表1 HPLC梯度洗脱条件

(2)标准曲线制备

分别吸取混合标准储备液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于5支50 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0、5、10、20、40、80 μg/mL系列混合标准溶液，于液相色谱仪进样分析，以各标准色谱峰保留时间定性，峰面积外标法定量，绘制标准曲线。

(3)样品前处理

膨化食品：称取薯片2.00～5.00 g，粉碎后于25 mL带刻度具塞比色管中，加入甲醇定容至25mL，加塞混合后置于超声波水浴中处理15 min，取适量样液以6 000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，进样测定。

食用油脂：称取食用油样品5.00 g，于10 mL具塞比色管中，加入约6 mL甲醇，涡旋震荡1 min，静置待分层后吸取上层甲醇溶液于25 mL带刻度具塞比色管中，上述操作重复3次，将收集的上层甲醇溶液定容至25 mL，加入约2 g的中性氧化铝，振摇，静置后，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，进样测定。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择

由于试样中杂峰较多，容易产生假阳性，试验采用DAD检测器对待测组分进行紫外190～400 nm全波长扫描，确定280 nm为测定波长，360 nm为参比波长。为了筛除干扰物质，初步定性待测组分后进一步定量，提高了检测的灵敏度。

2.2 流动相的选择

设置两种配比的流动相进行试验，来考察3种抗氧化剂的分离效果：(1)甲醇-0.1%甲酸(体积比12∶88)；(2)甲醇-0.1%甲酸梯度淋洗方法。图1为采用甲醇-0.1%甲酸(体积比12∶88)为流动相时的标准样品色谱图，图2为采用梯度淋洗时标准样品色谱图。

图1 甲醇-0.1%甲酸(体积比12∶88)为流动相时标准样品色谱图

图2 甲醇-0.1%甲酸梯度淋洗时标准样品色谱图

由图1、图2可见，采用梯度淋洗分离效果较好，3种组分在13 min内能很好地分离，分离度不低于1.5，峰纯度好且峰形对称。因此流动相采用甲醇-0.1%甲酸梯度淋洗方法。

2.3 标准曲线

配制含BHA、BHT和TBHQ 3种抗氧化剂的混合标准系列溶液，各组分浓度均为0、5、10、20、40、80 μg/mL，在1.2(1)设定的色谱条件下进样测定。对系列标准溶液所得的色谱峰面积(x)和对应的浓度(y)进行线性回归，绘制标准曲线。各组分的线性方程、线性范围、相关系数见表2。由此可见各组分线性关系良好，符合定量要求。

表2 3种抗氧化剂线性方程

2.4 精密度、加标回收率和检出限

在1.2(1)色谱条件下对空白薯片和食用油两种样品进行3水平添加回收试验，每个添加水平取6个平行样，以3倍信噪比计算各组分的检出限。回收试验结果及检出限见表3、表4。

表3 薯片加标回收率、精密度及检出限(n=6)

表4 食用油加标回收率、精密度及检出限(n=6)

由表3、表4可知，加标回收率为85%～106%，相对标准偏差为1.2%～4.1%，BHA、BHT、TBHQ各组分检出限分别为0.5、0.5、1.0 mg/kg。该方法回收率较高，精密度较好，满足实际样品检测要求。

3 结论

(1)由于测定组分中，TBHQ与BHA极性相近，需选择优化流动相配比且使用梯度洗脱才能使各组分既快又好地分离。采用以甲醇- 0.1%甲酸的梯度洗脱方式，BHA、BHT和TBHQ具有良好的分离度，而且峰形基本一致，所有峰的保留时间重现性好。

(2)采用甲醇作为提取溶剂，与文献[2]和文献[6]采用的石油醚、乙腈等提取溶剂的前处理方法相对简单，回收率高。BHA、BHT和TBHQ最新测定标准NY/T 1602-2008采用甲醇-1%乙酸作为流动相[3]，其中1%乙酸的pH值小于2，超过一般色谱柱的酸性承受范围。色谱柱长时间在强酸流动相中易导致色谱柱上键合的基团水解，使填充基质硅胶卷曲，影响色谱柱的柱效。本研究采用甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相，相比标准更有利于色谱柱的稳定，延长色谱柱的使用寿命。

(3)精密度、回收率和检出限试验表明，该检测方法灵敏度、精密度和准确度均较高，符合检测要求。该方法同时测定食品中常见3种抗氧化剂，提取步骤简便，易操作，适用于日常食品中BHA、BHT和TBHQ的同时测定。

[1] GB 2760-2007 食品添加剂使用卫生标准[S].

[2] GB/T 23373-2009 食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)的测定[S].

[3] NY/T 1602-2008 植物油中叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)的测定 高效液相色谱法[S].

[4] 桂学琴.液相色谱法测定食品中抗氧化剂特丁基对苯二酚[J].安徽农业科学,2007,35(6):1 577-1 584.

[5] 仲岳桐.高效液相色谱法测定植物油中特丁基对苯二酚[J].中国食品卫生杂志,1997,9(2):11-13.

[6] 陈毓芳,奚星林,李宪华.高效液相色谱法同时测定食用油脂中叔丁基对苯二酚和叔丁基对羟基茴香醚[J].中国卫生检验杂志, 2007,17(7):1 163-1 164.

[7] 余涛,叶坚.高效液相色谱同时测定食品中BHA、BHT、TBHQ方法的研究[J]. 中国卫生检验杂志,2007,17(12):2 136-2 137,2 155.