短小芽孢杆菌C－9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

杨金莹，吕建仁，党宏月

(中国石油大学生物工程与技术中心，山东青岛 266555)

短小芽孢杆菌C－9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

杨金莹，吕建仁，党宏月

(中国石油大学生物工程与技术中心，山东青岛 266555)

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C－9中克隆得到葡聚糖内切酶基因，该基因包含1980 bp核苷酸，编码559个氨基酸，其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架，构建rDNA介导的多拷贝整合载体，实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比，含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。

葡聚糖内切酶;核糖体DNA;酿酒酵母;多拷贝整合

燃料乙醇是一种清洁的可再生能源［1］。传统乙醇的生产以含糖作物为原料，成本高，因此利用纤维原料［2］生产燃料乙醇具有广阔的发展空间。酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，具有安全、乙醇耐受性强、乙醇收率高等优点，但酿酒酵母由于缺乏降解纤维原料的酶，不能利用纤维原料直接发酵生成乙醇。已有纤维素酶基因被克隆并在酿酒酵母中进行活性表达的报道［3－5］。在这些研究中，纤维素酶通过质粒携带或基因组定点低拷贝整合的方式在酿酒酵母中进行表达。为提高纤维素酶在酿酒酵母中的活性和稳定性，需构建引导外源基因插入酵母染色体的多拷贝整合型载体。根据酿酒酵母较易发生同源重组的特点，使用重复序列作为整合载体的同源重组位点是提高外源基因在酵母基因组中拷贝数的有效途径［6］。酵母基因组中存在100～200个单元的rDNA重复序列［7］，以此为整合位点可提高外源基因在酵母中的拷贝数和稳定性［8－9］。笔者从短小芽孢杆菌中克隆得到葡聚糖内切酶基因，以酿酒酵母整合载体YIp5为骨架，构建其在酿酒酵母中的高效、稳定表达体系，引入酿酒酵母磷酸甘油激酶(PGK)强启动子，同时引入特定的酿酒酵母rDNA片段，构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体，提高纤维素酶基因在酿酒酵母中的稳定性和表达量。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

Bacillus pumilus C－9为产纤维素酶菌株，分离自湛江红树林土壤;Escherichia coli DH5α用于亚克隆受体菌株;Saccharomyces cerevisiae W303－1A为受体菌，由江南大学诸葛斌老师惠赠;YIp5为大肠杆菌－酵母穿梭质粒，由牛津大学K.Nasmyth实验室惠赠;质粒pMA91用于获得PGK启动子，由Sheffield University Wynne Ellis教授、上海交通大学秦胜营老师惠赠。

1.2 引物序列

所用到的引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用到的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 培养基

CMC固体筛选培养基：0.1%KH2PO4，0.5%NaCl，1%酵母提取物，1% 蛋白胨，1%CMC，1.5% 琼脂粉;高压灭菌后加入100 μg/mL羧苄青霉素和0.5 mol/L IPTG。

YPD培养基：1% 酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

SC 培养基：0.67%YNB，1%CMC－Na，1.5% 琼脂粉。

1.4 C-9基因组文库的构建及筛选

提取 Bacillus pumilus C－9基因组 DNA，经Sau3AⅠ部分酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收2～7 kb的DNA片段，与经BamHⅠ酶切并做去磷酸化处理的pUC19载体相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α构建基因组文库。纤维素酶基因阳性克隆子的筛选参照文献［10］进行。将筛选得到的阳性克隆子提取质粒并进行测序。

1.5 酿酒酵母多拷贝整合载体的构建

对S.cerevisiae rDNA序列进行分析，并设计引物SrF/SrR从其基因组DNA中扩增得到2227 bp的rDNA片段。将该片段替换酵母整合载体YIp5中的URA3基因，构建酿酒酵母多拷贝整合载体，命名为YS。1.5 kb的G418抗性基因用引物GF/GR以质粒pUG6.0为模板扩增得到。将该PCR产物经BamHⅠ－SalⅠ酶切后分别连入YIp5和YS中，得到YG和YSG。

以提取的质粒为模板，用引物CF/CR进行PCR扩增，得到两端带有BglⅡ酶切位点的葡聚糖内切酶的PCR产物，经BglⅡ酶切后连入经同样酶切并去磷酸化的pMA91载体，使纤维素酶基因置于酵母强启动子PGK的控制下，将该重组质粒命名为P－Endo。以P－Endo为模板，用引物PF/PR进行PCR扩增，得到包含有PGK启动子、终止子和纤维素酶基因的PCR产物，经SalⅠ酶切后分别连入酵母整合载体YG和YSG中，得到重组质粒YG－Endo和YSG－Endo。

1.6 酿酒酵母感受态的制备

从平板上挑取酿酒酵母W303－1A单克隆至10 mL YPD液体培养基，28℃，150 r/min培养过夜;将预培养的酵母转接入50 mL YPD培养基中，28℃震荡培养5～6 h，至对数增长期间(用紫外分光光度计测定菌体浓度，当光密度值介于0.6～1.2)。于3000 r/min，4℃离心2～3 min收集菌体。用20 mL预冷的无菌水重悬，离心。用10 mL预冷的YPD重悬，其中加入25 mmol/L DTT和20 mmol/L HEPES(pH=8.0)。28℃静置培养30 min后离心。用10 mLEp buffer(10 mmol/L Tris－HCl，pH=7.5，270 mmol/L蔗糖，1 mmol/L MgCl2)重悬，离心。用200～250 μL Ep buffer重悬，保持在冰上。

1.7 酿酒酵母的转化

质粒 Y－Endo 和 YSG－Endo 分别用 ApaⅠ、HpaⅠ酶切线性化后电转法转入酿酒酵母W303－1A感受态细胞，转化条件为：1000 V，4～5 ms。将转化子涂布在含有200 μg/mL G418的YPD平板上，28℃培养2～3 d。将所得到的菌株分别命名为S/YG－Endo和 S/YSG－Endo。

1.8 阳性克隆的鉴定

挑取转化子单克隆至含有200 μg/mL G418的YPD液体培养基中，28℃，160 r/min震荡培养2～3 d。提取其基因组DNA，用引物CF/CR进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.9 粗酶液的制备及酶活分析

参照文献［11］的方法制备粗酶液，羧甲基纤维素酶(CMCase)活力测定按文献［12］中的方法进行。酶活力单位定义为每分钟催化底物产生1 μmol葡萄糖作为一个活力单位。

2 结果分析

2.1 葡聚糖内切酶基因的克隆

利用刚果红染色定性检测纤维素酶活力的方法筛选基因组文库，得到2个表现纤维素酶活(周围有透明圈)的阳性克隆子，提取其质粒进行测序。测序结果表明，两个克隆的插入序列完全一致，插入片段全长4320 bp。利用NCBI的OFR Finder工具对该片段进行分析，发现该片段最长的开放阅读框(ORF)包含1980 bp，编码559个氨基酸残基，在其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列。该序列已提交Genbank，序列号为HM572322。

2.2 多拷贝酵母整合载体的构建

rDNA介导的多拷贝酵母整合载体YSG－Endo的构建流程见图1。为了凸显多拷贝整合载体的表达优势，同时构建了低拷贝整合载体YG－Endo。这两个整合载体均带有适用于酿酒酵母转化的G418显性选择标记，以及用于表达外源基因的PGK酵母强启动子－终止子。但是，YG－Endo以酿酒酵母URA3序列为整合位点，而YSG－Endo以酵母rDNA片段为整合位点，为高拷贝整合。基因组中。

图2 重组酿酒酵母产物的电泳结果Fig.2 Identification of recombinant yeasts by PCR

图1 转化酿酒酵母的重组载体构建流程Fig.1 Flow chart of construction of recombinant plasmid

2.3 酿酒酵母的转化及转化子验证

将平板上长出的转化子转接入含有200 μg/mL G418的YPD液体培养基中，提取其基因组DNA，并分别用引物CF/CR和GF/GR进行PCR扩增，扩增结果如图2所示。其中，M为D2000 DNA ladder;1为利用CF/CR引物，以重组酵母基因组DNA为模板进行扩增;2为利用CF/CR引物，以H2O为模板进行扩增;3为利用GF/GR引物，以重组酵母基因组DNA为模板进行扩增;4为利用GF/GR引物，以H2O为模板进行扩增。

由图2可以看出，在重组酿酒酵母基因组中，利用引物CF/CR可以扩增出约2 kb的DNA片段，引物GF/GR可以扩增出约1.5 kb的DNA片段，而在对照菌株中则没有扩增出目的条带。以上结果表明，纤维素酶基因和抗性基因已经整合入酿酒酵母

2.4 重组酿酒酵母纤维素酶活测定

酶活(细胞干重)测定结果如表2所示。由表2可以看出，纤维素酶在重组菌S/Y－Endo和S/YSGEndo中均得到了活性表达，而且S/YSG－Endo中纤维素酶活比S/Y－Endo的酶活提高了2.28倍，说明多拷贝整合菌株的构建提高了外源基因的表达水平。

表2 重组酵母中纤维素酶酶活分析Table 2 Enzymatic activity analysis of cellulose in recombinant yeast

2.5 重组酿酒酵母在纤维素碳源培养基上的生长

将重组酿酒酵母和出发菌株分别涂布在以CMC－Na为唯一碳源的SC固体培养基上，其生长结果如图3所示。

图3 重组酿酒酵母在CMC碳源上的生长Fig.3 Cell growth of recombinant yesats on plates with CMC as carbon source

由图3可以看出，重组菌 S/Y－Endo和 S/YSGEndo均可在以CMC－Na为唯一碳源的培养基上生长，而对照菌株未见生长。

3 结论

(1)从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C－9中克隆到葡聚糖内切酶基因，并提交Genbank，其序列号为HM572322。

(2)以大肠杆菌－酵母穿梭质粒YIp5为骨架，构建rDNA介导的酿酒酵母多拷贝整合质粒，实现葡聚糖内切酶基因在酿酒酵母中的稳定、高效表达。与URA3介导的整合重组酵母相比(S/YG－Endo)，rDNA介导的整合重组酵母(S/YSG－Endo)的纤维素酶活提高2.28倍。

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Cloning of glucanase gene from Bacillus pumilus C-9 and its expression in Saccharomyces cerevisiae

YANG Jin－ying，LÜ Jian－ren，DANG Hong－yue
(Center for Bioengineering and Biotechnology of China University of Petroleum，Qingdao 266555，China)

The glucanase gene was obtained from Bacillus pumilus C－9，the open reading frame of glucanase consists of 1980 nucleotides encoding a protein of 559 amino acids with a predicted signal peptide of 29 amino acids at the N－terminal.To achieve the stable and high efficient expression in Saccharomyces cerevisiae，a multicopy integration plasmid was constructed by introducing the rDNA sequence into the plasmid YIp5.The recombinant Saccharomyces cerevisiae could grow on the plates with carboxymethyl cellulose as the sole carbon source.

glucanase;rDNA;Saccharomyces cerevisiae;multicopy integration

Q 945.11

A

10.3969/j.issn.1673－5005.2011.03.029

1673－5005(2011)03－0144－04

2011－01－08

杨金莹(1978－)，女(汉族)，山东新泰人，博士研究生，研究方向为新能源与可再生能源。

(编辑 刘为清)