酸菜水分离提取小肽类天然防腐剂

陈 兵 原 韬

(1.鸡西大学 安全与环境工程系，黑龙江 鸡西 158100；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150001；3.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150001)

我国东北地区的冬季，酸菜基本上是家家户户不可缺少的食品，剩余的酸菜发酵液基本上都废弃倒掉。随着对日常健康保健重视的不断提高，人们已经清楚食品中的防腐剂在发挥作用的同时也带来了很严重的副作用，特别是化学防腐剂的副作用更加凸显。因此寻求一种高效抑菌并低毒的绿色天然防腐剂是21世纪生物技术行业的一项任务。已经发现的这类防腐剂主要以乳酸链球菌素为主，是一种多肽类化合物，具备高效绿色防腐的功效，是乳酸菌代谢产生的一种细菌素，能抑制引起食物腐败变质的微生物和一些致病微生物的生长。目前已有将其作为食品防腐剂的相关报道[1]。结合废物再加工的环保理念，可以从具备乳酸菌代谢条件的体系中来提纯乳酸链球菌素。酸菜水这种基质体系完全符合上述条件，乳酸菌把白菜中糖类代谢分解成乳酸的过程[2]，菌体自身便积累细菌素产物。

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

酸菜水(酸菜发酵液)，主要从当地酸菜食品加工厂获得；

检测培养基：酵母膏，蛋白胨，蔗糖，氯化钠，磷酸氢二钠(12个结晶水)，pH7.0；

抑菌试验指示菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，由鸡西大学实验室提供；

CM Sephadex C-25凝胶；

标准Nisin样品，Sigma公司；

标准分子量蛋白系列Mark；

盐析用硫酸铵；

截留分子量1500单位透析袋；

尿素，SDS-PAGE 。

1.2 仪器设备

垂直板电泳仪及配套电泳槽；

紫外线分光光度计；

桌面式超净工作台；

层析柱；

真空旋转水浴蒸发仪；

牛津杯。

2 实验方法步骤

2.1 酸菜液预操作

取500ml酸菜水，常温4 000～5 000r/min离心处理20min，弃除下层杂质和菌体泥状混合物，提取上清液。将上清液用抽真空水浴式旋转蒸发仪45℃减压浓缩10倍。

2.2 盐析收集抑菌活性物质

向50ml浓缩液缓缓加入30%硫酸铵，时时搅拌。沉淀完全后于4℃静止放置4h。4℃15 000r/min离心处理15min。分别标记离心管。取每管上清液和沉淀分别采用牛津杯水平琼脂扩散实验进行抑菌试验，同时用30%硫酸铵溶液做空白。测定上清液和沉淀的抑菌圈直径。

图1 30%(NH4)2SO4盐析后抑菌圈测定

表130% (NH4)2SO4盐析抑菌圈测定

将抑菌效果不明显的标记离心管中的上清液于4℃缓缓加入60%硫酸铵，时时搅拌。于4℃静止放置并过夜，4℃15 000r/min离心处理15min，同上步操作进行抑菌和对照实验。

图2 60%(NH4)2SO4盐析后抑菌圈测定

表260%(NH4)2SO4盐析抑菌圈测定

取两次盐析抑菌效果最佳的离心管中的沉淀备用。

2.3 除去备用沉淀样品中硫酸铵盐

将备用样品加入截留相对分子质量1 500左右的透析袋内，蒸馏水作透析外液，4℃下透析，同时用氯化钡检测透析袋内没有硫酸钡产生为止。将透析袋内样品作下一步实验备用。

2.4 层析分离抑菌活性物质

将CM Sephadex C-25凝胶经过加热、洗涤、蒸煮、活化等预处理后装入层析柱，固定好后检查凝胶应为均匀堆积无局部裂缝状态。采用醋酸—醋酸钠(HAc-NaAc)作为洗缓冲脱液，将透析后样品上样后，人工方式用层析管接收洗脱液，标准为1ml/管，并做好标记。洗脱液使用顺序是先25ml醋酸缓冲液，再40ml KCl(0.02mol/L)。

收集完毕后在280nm下用紫外分光光度计测定各管的紫外吸光值，混合吸光值较大的层析管内液体组分(即收集65号至80号管内液体)。

2.5 干燥制备成品

将上述吸光值大的组分混合进行冷冻干燥，得到成品干粉。

2.6 冻干粉抑菌活性检验

将干粉样品用0.01mol/L稀盐酸溶解后稀释成1mg/ml，以枯草芽孢杆菌为指示菌进行抑菌活性检测。并与标准Nisin进行对比抑菌圈[3]。

图4 抑菌活性检测对比

2.7 冻干粉相对分子量测定

使用垂直板电泳仪，结合Urea—SDS—PAGE凝胶电泳法测定分子量[4]。

图5 电泳图谱带

3 结论

经过电泳分析后，样品出现两条明显谱带，分子量分别为3 500Da和22 000Da左右。即图5中黑框所指示谱带。与Nisin相似[5]，具备蛋白质性质且分子量较小，属于肽类物质，有抑菌活性。可以规模提纯酸菜水中的抑菌活性物，或者分离纯培养产生抑菌活性物质的菌株，来生产绿色天然防腐抑菌产品，有望大规模投向食品工业，弥补市场空白与不足。

[1]Hurst A.Nisin and other inhibitory substances from acid bacteria[A].In:A Branen,P N Davidson 320～353.

[2]葛菁萍，邹鹏，宋刚,等.酸菜发酵液中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品工业科技，2007,28(10):83～84.

[3]李秀凉，雷宏，孟博，等.肽类抑菌物质效价测定[J].食品科技，2006,(2)：113～116.

[4]迟玉杰，王丽秋，高学军，等.用尿素—SDS—PAGE凝胶电泳测定乳链菌肽分子量[J].中国乳品工业，1998,(2)：12～13.

[5]陶勇.Nisin及其在食品防腐方面的应用[J].食品科技，2008,(2):53～57.