乙酸阴道热敏凝胶剂在家兔阴道内的药动学

田芳，成倩倩，俸灵林，王玉柱，李卫华，丁训诚

(1.上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室，上海200032;2.复旦大学公共卫生学院劳动卫生毒理学教研室，上海200032)

乙酸阴道热敏凝胶剂在家兔阴道内的药动学

田芳1，2，成倩倩1，2，俸灵林1，王玉柱1，李卫华1，2，丁训诚1

(1.上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室，上海200032;2.复旦大学公共卫生学院劳动卫生毒理学教研室，上海200032)

目的研究乙酸阴道热敏凝胶剂经阴道给药后药物在家兔阴道内的药代动力学特征，探索适合阴道用药的新剂型。方法3 ml含乙酸36.23 mg的乙酸阴道热敏凝胶剂推入家兔阴道内，给药后0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20和24 h，对家兔阴道进行灌洗并测定灌洗液中乙酸的含量、用微电极插入阴道测定阴道pH值、取阴道组织匀浆后测定组织中乙酸含量。采用非线性最小二乘法进行计算机拟合获得药动学参数。结果乙酸阴道热敏凝胶剂置入家兔阴道后，阴道pH值由给药前中性(pH 6.67)转变为酸性(pH 3.56)，阴道pH 3.5～4.0可保持约6 h;pH 3.5～4.5可保持约12 h;pH 3.5～5.0可保持19 h;给药后24 h，pH值为5.32±0.24，乙酸含量为(0.38±0.15)g·L－1，为给药量的11%。阴道组织中乙酸浓度峰值为600 μg·g－1，达峰时间为2 h，平均保留时间为7.73 h，药物动力学参数符合二室模型。结论乙酸阴道热敏凝胶剂符合阴道用药的要求。

热敏凝胶;醋酸;阴道;药代动力学

生殖道感染是指由病原微生物和寄生虫引起的生殖道疾病，已成为全球特别是发展中国家危害严重的生殖健康和公共卫生问题［1］。目前，临床用于治疗细菌性阴道炎(bacterial vaginosis，BV)的措施主要是经口服或阴道局部给药，尽管给予充分的抗生素治疗后短期内有效，但停药后BV的复发率仍然很高。特别值得注意的是，在BV复发的患者中存在持续的阴道高pH值(pH＞4.7)［2］，如果不能恢复正常pH，会促进BV复发，推测BV的发生或复发还与阴道微生物失衡有关。国外某些制药公司研发一些非抗生素药物，例如阴道酸性凝胶剂，用于恢复和维持阴道酸性，构建湿润的阴道上皮保护膜，重建阴道正常的微生态平衡，增加阴道抗菌防御能力，并结合抗生素治疗，可提高BV的治愈率与减少BV的复发［3－7］。

迄今为止，国内尚未制定阴道药物局部药代动力学(简称药动学)研究的规范和评价标准。本文根据国外相关文献［8］，初步探讨了乙酸阴道热敏凝胶剂在阴道局部的药动学过程，以期为今后阴道用药的局部药动学研究方法提供参考。

同时，乙酸阴道热敏凝胶剂选用乙酸为模型药物，辅以热敏凝胶新剂型，观察其对家兔阴道给药后，新剂型中乙酸在阴道局部的含量与pH值之间相关性、以及阴道组织中乙酸的动力学，为乙酸阴道热敏凝胶剂进一步药效学评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙酸(广东台山市新宁制药厂);泊洛沙姆407(德国BASSF公司);羟丙甲基纤维素(HPMC K4M，美国DOW公司);甘油(杭州油脂化工有限公司);乙酸阴道热敏凝胶剂(自制，pH 3.5～3.7);苯甲酸雌二醇(苏州市苏瑞医药化工公司)。

Delta 320型精密数字pH计及100 μl微量电极配件(瑞士Mettler公司);酸碱滴定管(上海玻璃仪器厂);78-1A型磁力加热搅拌器(上海电广凡器材厂);XS205 Dual Range电子分析天平(瑞士Mettler公司);微量进样器(上海医用激光仪器厂)。

1.2 动物

封闭群日本大耳兔，雌性，76只，体质量(2.8±0.2)(±s)kg，动物许可证号:SCXK(沪)2002-0012，由上海市松江区松联试验动物场提供。

1.3 药物配制

将处方量的HPMC和甘油加入到乙酸0.1 mol·L－1缓冲液(pH 3.6)中，搅拌溶解，然后加入处方量泊洛沙姆407(poloxamer407，P407)，搅拌使其分散均匀，置于4℃下至聚合物完全溶解，得到无色澄明的凝胶溶液。它能随外界温度由液态(≤28℃)转变为凝胶状(≥29℃)。

1.4 乙酸含量及阴道pH值的测定［9］

氢氧化钠酸碱滴定法测定乙酸含量，参照《中国药典》2010年版二部“冰乙酸”中含量测定项。将家兔置仰卧位，将MI-4146P型微电极插入阴道2～3 cm处，静置2～3 s后，测定阴道pH值。

1.5 生物样品的采集及预处理

66只雌性家兔，给药前注苯甲酸雌二醇0.1 mg，使家兔性周期同步。给药时家兔置仰卧位，用12 cm长的聚乙烯弹性导尿管连接吸有3 ml(含乙酸36.23 mg)乙酸阴道热敏凝胶剂的5 ml玻璃注射器，经插入家兔阴道内4～5 cm深处导尿管理推入凝胶。凝胶注入阴道后的0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20和24 h，吸新煮沸的预冷双蒸水10 ml对各组家兔阴道进行灌洗，用咯痰接收管收集从阴道口流出的灌洗液全量，置15 ml离心管中，在4℃下，150×g离心15 min，全部上层液置具塞锥形瓶中，以备乙酸含量的检测。

收集灌洗液后，耳静脉空气注入法处死家兔，取出阴道组织，去尽周围结缔组织，纵向切口阴道，用滤纸吸去表面水分，称湿重，取适量阴道组织剪碎置入一定量新沸过的冷双蒸水中，用高速匀浆器制成50%(W/V)组织匀浆，在4℃下，150×g离心15 min，取出全部上清液置－20℃备用。

1.6 空白样品的制备

10只雌性家兔分为2组。按1.5项制备未给药家兔的阴道灌洗液和阴道组织上清液，5份用于制备标准曲线，5份加入乙酸分别配制6.0，25.0和45.0 g·L－1的阴道灌洗液和0.6，3.0和6.0 g·L－1的阴道组织样品，以备方法学的验证。

1.7 实验结果数据采用±s表示。采用Stata8.0软件及DAS药动学软件进行药动学参数估算及统计分析。

2 结果

2.1 阴道灌洗液和组织中乙酸标准曲线的制备及检测限的确定

2.1.1 阴道灌洗液中乙酸标准曲线的制备

精密称取乙酸5，10，25，30和50 mg，加入到含10 ml新沸过的预冷双蒸水的具塞锥形瓶中，摇匀后，按照酸碱滴定法，记录消耗氢氧化钠滴定液的量(ml)，采用最小二乘法进行线性回归，采用Stata软件测得工作曲线的线性方程:Y=6.0329X－0.9198〔R2=0.9970，X:氢氧化钠滴定量(ml);Y:乙酸量(mg)〕。

2.1.2 阴道组织中乙酸标准曲线的制备

精密称取乙酸0.4，0.8，1.9，3.8和7.0 mg，分别置于装有上清液的具塞锥形瓶中，按酸碱滴定方法操作，记录测得消耗NaOH滴定液的量(ml)，采用最小二乘法拟合校准标准曲线，采用Stata测得工作曲线的线性方程:Y=5.8258 X+0.0455〔R2=0.9968，X为氢氧化钠滴定量(ml)，Y为乙酸量(mg)〕。

2.1.3 检测限的确定

根据《中国药典》非仪器分析目测法，本氢氧化钠酸碱滴定条件下，乙酸的最低检测量为0.16 mg。

2.2 乙酸在阴道灌洗液和阴道组织中的精密度和回收率

取制备好的阴道灌洗液和阴道组织上清液样品，按乙酸含量的测定项操作，分别于一日内测定5次和每日测定1次，连续测5 d，计算日内、日间变异系数。由表1结果可见，各浓度阴道灌洗液和阴道组织上清液的日内变异系数＜3.2%和＜8.02%，日间变异系数＜3.26%和＜11.63%。样本中乙酸回收率检测下限时为83.1%，其他为90%～110%。

表1 乙酸在阴道灌洗液和阴道组织中的变异系数和回收率Tab.1 Precision and recovery of acetic acid in vaginal lavage and tissue

2.3 乙酸在阴道灌洗液和阴道组织中的回收率

取制备好的含不同浓度乙酸的阴道灌洗液和阴道组织上清液样品，按前述乙酸含量的测定操作。结果空白阴道灌洗液和空白阴道组织上清液中3个浓度下的回收率分别为(100.9±2.9)%，(99.3±1.5)%，(98.3±2.7)%以及(83.1±5.4)%，(90.6±3.4)%，(92.1±5.2)%。

2.4 乙酸在阴道灌洗液和阴道组织液中的稳定性

分别配制乙酸含量为25 g·L－1的阴道灌洗液和3.0 g·L－1的组织匀浆上清液，在室温下放置，分别于0，2，4，6，8，12和24 h，按酸碱滴定法进行乙酸含量测定，计算其相对误差。如表2所示，阴道灌洗液和阴道组织上清液中乙酸含量的相对标准差分别为3.9%和6.6%，乙酸含量无明显变化，保持稳定。

表2 乙酸在阴道灌洗液和阴道组织中的稳定性Tab.2 Stability of acetic acid in vaginal lavage and tissue

2.5 乙酸阴道热敏凝胶剂的药动学

2.5.1 阴道灌洗液中乙酸阴道热敏凝胶剂的药动学

阴道灌洗液内乙酸浓度和阴道pH值呈负相关(图1)。将所得灌洗液中的乙酸含量和阴道pH数据用Stata8.0软件的Boxcox程序对残留量和时间进行曲线拟合，得出:

根据式(1)和(2)分别计算出乙酸浓度和保留时间，见表3。

图1 阴道灌洗液中乙酸浓度与阴道pH值的关系.±s，n=11.Fig.1 Correlation between pH of vaginal lavage fluid and acetic acid content.

表3 阴道灌洗液中乙酸浓度与阴道pH值的关系Tab.3 Correlation between retention content of acetic acid and pH value

由图1和表3可见，乙酸阴道热敏凝胶剂置入家兔阴道后，由中性pH值(6.67)立即转化为酸性(pH=3.56)，以后pH值逐渐升高，在给药后24 h家兔阴道pH值可达到5.32±0.24，此时相对应乙酸含量亦由3.62 g·L－1下降到0.38 g·L－1。说明，家兔阴道酸化程度与相应时间点的乙酸量密切相关。根据式(2)计算出乙酸阴道热敏凝胶剂置入家兔阴道后，阴道pH 3.5～4.0可保持约6 h;阴道pH 3.5～4.5可保持约12 h;阴道pH 3.5～5.0可保持19 h，提示本品经阴道给药后，能保持阴道酸性(pH≤5)的时间较持久，适合阴道用药的要求。

2.5.2 乙酸阴道热敏凝胶剂在阴道组织的药动学

根据AIC法，阴道组织中乙酸药物-时间曲线(药-时曲线)以二室模型(图2)为最佳组合，通过药动学软件(DAS)计算出的药动学参数见表4。

图2 阴道组织内乙酸的药物-时间曲线.±s，n=11.Fig.2 Drug-time curve of acetic acid in vaginal tissue.

由表4可见，家兔经阴道给予乙酸阴道热敏凝胶剂后，Tmax和cmax分别为2 h和600 μg·g－1，乙酸半衰期t1/2α为1.00 h，消除相半衰期t1/2β为12.44 h，消除速率常数小，平均滞留时间(0～24 h)为7.73 h。提示本品中乙酸能在阴道组织内蓄积，阴道组织中乙酸的消除与阴道黏膜表面乙酸的消失规律较一致，乙酸中H+可在较长时间内维持阴道的酸性环境。

表4 家兔经阴道给药后乙酸的药动学参数Tab.4 Pharmacokinetic parameters of acetic acid in rabbit vaginal tissue after vaginal administration

3 讨论

本研究结果显示，家兔阴道给予乙酸阴道热敏凝胶剂3.0 ml(含乙酸36.23 mg)后12 h，乙酸含量为7.03 mg，为给药量的19%，同时家兔阴道可保持pH 4.5的酸性环境;给药后24 h，乙酸含量为给药量的11%，阴道可保持pH 5.0的酸性微环境。本品乙酸阴道热敏凝胶剂中乙酸在阴道保留时间的特点，与王成伟等［10］研制的温度敏感性壬苯醇醚阴道用缓释凝胶在大鼠阴道灌洗液中的壬苯醇醚含量变化十分相似。

与市售普通阴道凝胶剂相比，热敏凝胶剂型可以显著提高阴道内药物的滞留性能［10］。Prudhome等［11］报道，一定浓度的P407溶液以球状胶束包裹简单立体网状结构的形成存在。在室温时，胶束间相对独立，呈各向同性的牛顿流体，置入阴道后，P407随着温度的升高，胶束间堆砌和缠结，形成非牛顿流体。这种转变与P407浓度有关，当P407浓度固定时，黏度的变化可受药物及处方中添加剂的影响。当P407液体置入阴道后，发生相转变，形成凝胶体系，在这一短暂的相变过程中，热敏凝胶可以迅速铺展并填充阴道黏膜皱褶的表面，黏附性佳，可延长药物在阴道的保留时间，从而提高生物利用度。

计算所得各项参数表明，家兔阴道组织中乙酸含量的药-时曲线符合二室模型，最大滞留浓度的峰值出现在给药后2 h，消除相半衰期t1/2β为12.44 h，消除速率常数小，保持阴道的酸性(pH≤4.5)的平均保留时间达11.292 h。由实验结果可以推测乙酸阴道热敏凝胶剂中乙酸在阴道内的处置过程为:由热敏凝胶与黏液形成的薄膜黏附在上皮细胞表面，延长酸化时间，也延缓药物的释放，达到延效和增效作用;此时，在凝胶中部分乙酸(HAc电解成的H+)不断渗入黏膜下组织，有蓄积效应，对维持阴道低pH值的酸性环境起到重要作用，一部分H+和Ac－进入血管，被血液中的HCO3－/H2CO3缓冲对中和，因此实验中家兔的外周血液中pH值始终保持稳定。

众所周知，阴道的酸性微环境和乳杆菌属(Lactobacillus)等微生态的平衡是一种自身保护机制。因此，维持阴道酸性微环境是平衡阴道微生态最重要的因素之一［12］。反之则会导致阴道微生态失调，减轻阴道自身防御功能，从而诱发BV。本研究提示，乙酸阴道热敏凝胶剂经阴道给药后滞留性好，能保持阴道酸性(pH≤5)的时间较持久，适合阴道用药的要求。

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Pharmacokinetics of acetic acid thermoreversible vaginal gel in rabbits vagina

TIAN Fang1，2，CHENG Qian-qian1，2，FENG Ling-lin1，WANG Yu-zhu1，LI Wei-hua1，2，DING Xun-cheng1
(1.National Laboratory of Drugs and Devices for Family Planning，Shanghai Institute of Planned Parenthood
Research，Shanghai200032，China;2.Department of Occupational Health and Toxicology，School of Public Health，Fudan University，Shanghai200032，China)

OBJECTIVETo investigate the pharmacokinetics of acetic acid thermoreversible gel(Ace-Acid Gel)in rabbits vagina.METHODSThree microliter Ace-Acid Gel(containing 36.23 mg acetic acid)was given to the 66 rabbits through vagina.At 0.25，0.5，1，1.5，2，4，8，12，16，20 and 24 h after administration，acetic acid content in rabbit vaginal lavage fluid and in homogenated vaginal tissues were measured.Vaginal pH was detected with a microelectrode inserted into the vagina，and pharmacokinetic parameters were calculated using nonlinear least squares fitting model.RESULTSAfter Ace-Acid Gel administration，vaginal pH changed from neutral(pH 6.67)to acidic(pH 3.56).The pH value was maintained at 3.5－4.0 for 6 h，at 3.5－4.5 for 12 h，and at 3.5－5.0 for 19 h.At 24 h，the pH value was 5.32±0.24 and the acetic acid content was(0.38±0.15)g·L－1(11%of administered dose).The concentration-time curve fitted in with the two-compartment model.The peak concentration(cmax)of acetic acid in vaginal tissue was 600 μg·g－1，peak time(Tmax)was 2 h，and the mean residence time(MRT0－24)was 7.73 h.CONCLUSIONThe new formulation is suitable for vaginal delivery.

thermoreversible gel;acetic acid;vagina;pharmacokinetics

The project supported by National Science and Technology Major Project(2008ZX1001-015);the Elevnth Five-Year Plan National Key Technology Research and Development Program(2006BAI03B09);Foundation of Shanghai Population and Family Planning Commission(2009JG06);and Foundation of Shanghai Committee of Science and Technology(1052nm05600)

R969.1，R984

A

1000-3002(2011)05-0469-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.010

国家科技重大专项(2008ZX1001-015);十一五科技支撑项目(2006BAI03B09);上海市人口与计划生育委员会项目(2009JG06);上海市科学技术委员会项目(1052nm05600)

田芳(1985－)，女，硕士，主要从事生殖毒理学研究。

李卫华，E-mail:imliweihua@yahoo.com，Tel:(021)64171045，Fax:(021)64046128

Correspondence author:LI Wei-hua，E-mail:imliweihua@yahoo.com，Tel:(021)65171045，Fax:(021)64046128

2011-01-27接受日期:2011-05-23)

(本文编辑:付良青)