Fe3+配位对水溶性大豆多糖性质的影响*
2011-01-12何瑞雪高文宏曾新安朱思明
何瑞雪，高文宏，曾新安，朱思明
1(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510640)2(广州现代产业技术研究院，广东广州，511458)
抗氧化与人类的健康密切相关，有关研究表明，各种自由基如羟基自由基、超氧阴离子自由基等所引发的氧化作用是导致身体中各组织器官损伤、病变的重要原因之一，人类许多疾病如癌症、心脏病、衰老过程等均与自由基造成的氧化损伤、脂质过氧化、抗氧化酶活力降低等有关［1－6］，抗氧化活性物质能清除自由基并保护人体健康。此外，强致癌物质亚硝胺的前体亚硝酸盐大量存在于食物中及产生于食物在体内的代谢过程中，因此，阻断亚硝胺合成或消除亚硝胺的前体是预防癌症的有效途径之一［7］。
近年来，多糖铁配合物成为研究热点，它具有副作用小、易吸收等优点，符合理想的口服补铁剂的国际标准，是一类值得研究开发的新型补铁剂［8］。豆制品副产物豆渣中含有大量SSPS(水溶性大豆多糖)，具有多种生物活性，如膳食纤维功能、抗氧化性、乳化及乳化稳定性等，是一种天然的功能性成分［9］，作为廉价易得的原料，对其与Fe3+配合后得到的SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的研究具有重要意义。本文以SSPS为原料，用柠檬酸三钠-三氯化铁法［10］合成SSPS-Fe(Ⅲ)配合物，并对SSPS与铁配合前后的抗氧化性质进行了研究，以期得到一种具有多种生物活性的新型补铁剂或强化铁的食品添加剂。
1 实验材料与仪器
1.1 材料与试剂
水溶性大豆多糖(江苏欣瑞食品科技发展有限公司，纯度≥80%，水分≤7.0%，粗蛋白质≤8.0%，粗灰分≤10.0%);大豆卵磷脂;邻菲罗啉、盐酸、盐酸羟胺、醋酸钠、亚铁氰化钾、抗坏血酸、氢氧化钠、三氯化铁、柠檬酸三钠、硫酸亚铁、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、水杨酸、双氧水、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TU－1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;TGL-20bR型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;85-2恒温磁力搅拌器，常州澳华仪器有限公司;KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;1835乌氏毛细管黏度计，上海隆拓仪器厂。
2 实验方法
2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的制备
称取水溶性大豆多糖 1.920 g、柠檬酸三钠1.000 g，用100 mL蒸馏水溶解，置于69.7℃水浴中搅拌，同时缓慢滴加2 mol/L的三氯化铁溶液和0．2 g/mL的NaOH溶液，保持反应液pH 8.89，当产生红棕色不溶物时停止滴加三氯化铁溶液和氢氧化钠溶液，继续水浴搅拌1.41h，冷却后离心，上清液用无水乙醇醇析，醇析所得沉淀分别用体积分数95%乙醇、无水乙醇、无水丙酮洗涤，真空干燥后得 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物。
2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的理化性质测定
2.2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物含铁量的测定
采用邻菲罗啉分光光度法测定SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的含铁量，标准曲线的绘制参见文献［11］。准确称取2.1所得的SSPS-Fe(Ⅲ)配合物0.025g，蒸馏水溶解后定容于50 mL容量瓶中，准确移取0.50 mL溶液于25 mL比色管中，加入10%的HCl 0.5 mL，10%的盐酸羟胺1 mL，放置30 min，再加入0.15%邻菲罗啉显色液2 mL和10%醋酸钠溶液5 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，显色10 min后，于510 nm处测定吸光度值A。根据回归方程计算Fe(Ⅲ)含量。
2.2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的稳定性
取少量SSPS-Fe(Ⅲ)配合物溶于水，慢慢滴加亚铁氰化钾溶液，振荡试管，观察现象。
2.2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水解
将 FeCl3、FeSO4、SSPS-Fe(Ⅲ)分别溶于蒸馏水，配制成浓度为0.01 mol/L的铁溶液［SSPS-Fe(Ⅲ)中Fe浓度为0.01 mol/L］，准确量取3种溶液各20 mL，分别用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液滴定，同时用酸度计测定溶液的pH值，观察现象。
2.2.4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物黏度的测定
分别配制浓度为10 mg/mL的SSPS-Fe(Ⅲ)溶液及SSPS溶液，以0.8mm乌氏毛细管黏度计30℃常规测定。
2.2.5 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的还原性［12］
配制0.5 mg/mLSSPS-Fe(Ⅲ)溶液，取10 mL移入100 mL容量瓶中，分别取4份，然后各加入1%抗坏血酸溶液 1、2、3、4 mL，再加入 5 mL 0.15% 的邻菲罗啉溶液及5 mL 10%的醋酸钠溶液，用纯水定容至刻度，摇匀，在37℃下水浴反应，分别在不同反应时间点取样，以不加SSPS-Fe(Ⅲ)的溶液为空白，在510 nm波长处测定吸光度值A。
2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的抗氧化活性测定
2.3.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对羟基自由基的清除活性［13］
25 mL比色管中依次移取5 mL2 mmol/L硫酸亚铁溶液和5 mL6 mmol/L双氧水，混合均匀后用6 mmol/L水杨酸溶液定容至刻度，摇匀后立即测A0值。在A0值测定体系中，加入1 mL样品溶液，摇匀后立即测A1值，以不加水杨酸溶液为样品空白，测定A10值。清除率可根据下式进行计算:
2.3.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对亚硝酸盐的清除活性
亚硝酸盐清除率的测定采用盐酸萘乙二胺法:参照文献［14］的方法，平行做3次求平均值，同时做空白对照实验。
其中:A0为未加样液时NaNO2的吸光度(以不加样液及NaNO2的试剂空白为参比溶液)，A为加入样液后NaNO2的吸光度(以不加NaNO2，加入样液的试剂为参比溶液)。
2.3.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对脂质抗氧化的活性
脂质体的制备:称取20 mg卵磷脂溶入5 mL的0.05 mol/L(pH 7.4)的磷酸缓冲液中，在超声发生器中超声处理，直至脂质体完全溶解，所得液体为单层小体积脂质体，置于0℃条件下保存。
脂质过氧化的测定方法:参照文献［15］的方法，平行做3次，计算样品对脂质体过氧化的抑制率。
其中:A模为模型管的吸光度(以不加FeSO4为参比溶液)，A样为样品管的吸光度(以不加FeSO4为参比溶液)。
3 结果与分析
3.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的理化性质
3.1.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的含铁量
由标准曲线 A=0.199 67c－0.000 17，R2=0.999 97得配合物含铁量为18.1%(其中A为吸光度值，c为铁离子浓度mg/L)。
3.1.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的稳定性
在SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水溶液中滴入亚铁氰化钾溶液，结果不显示Fe3+的特征反应，表明游离的Fe3+浓度极小，不能被检测出来，说明Fe3+基本上形成了SSPS-Fe(Ⅲ)的稳定配合物。
3.1.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水解
FeCl3开始浑浊时的pH值为2.65，出现大量浑浊时的pH值为6.72;FeSO4开始浑浊时的pH为3.35，出现大量浑浊时的pH为6.79;SSPS-Fe(Ⅲ)配合物在pH 1～14内不沉淀。
3.1.4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的黏度
SSPS与铁配合后特性黏度增大(见表1)，表明多糖与铁形成配合物后，分子质量增大、分子形状发生改变或分子内部松散度增大而使黏度增大。
表1 配合物的特性黏度
3.1.5 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的还原性
由图1可知，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物中的铁的溶出量及还原速度受加入还原剂抗坏血酸量的影响，随着抗坏血酸加入量的增加，铁的溶出量及还原速度都逐渐增大，从1 mL到3 mL，溶出量及还原速度急剧增大，4 mL后增加不大，在5.5 h左右基本达到平衡。
图1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的还原性
3.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的抗氧化活性
3.2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对羟基自由基的清除活性
SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS对羟基自由基的清除率如图2所示。SSPS与SSPS-Fe(Ⅲ)对羟基自由基都有清除活性，活性随着浓度的增加而增大，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对羟基自由基的清除活性比SSPS大得多。在浓度为10 mg/mL时，SSPS对羟基自由基的清除率为16.0%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对羟基自由基的清除率为29.6%
图2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS对羟基自由基的清除活性
3.2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对亚硝酸盐的清除活性
SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS对亚硝酸盐的清除率见图3。由图3可以看出，SSPS与SSPS-Fe(Ⅲ)对亚硝酸钠都有清除活性，活性随着浓度的增加而增大，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对亚硝酸钠的清除活性比SSPS大。在浓度为10 mg/mL时，SSPS对亚硝酸盐的清除率为53.9%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对亚硝酸盐的清除率为67.5%，
图3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS对亚硝酸钠的清除活性
3.2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对脂质抗氧化的活性
SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS对脂质过氧化的抑制作用如图4所示。由图4可知，SSPS与SSPS-Fe(Ⅲ)对脂质过氧化都有抑制作用，随着浓度的增加抑制作用增强，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对脂质过氧化的抑制作用明显高于SSPS。在浓度为10 mg/mL时，SSPS对脂质体氧化的抑制率为34.9%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物对脂质体氧化的抑制率为77.9%。
图4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS抑制脂质过氧化的能力
4 结论
(1)采用柠檬酸三钠-三氯化铁法合成了SSPSFe(Ⅲ)配合物，Fe3+与SSPS基本上形成了稳定的配合物，且在pH值1～14内不沉淀，其特性黏度比SSPS大，含铁量为18.1%，配合物中铁的溶出量及还原速度受加入还原剂抗坏血酸量的影响，随着抗坏血酸加入量的增加，铁的溶出量及还原速度都逐渐增大，可根据人体内食物的消化特性补充一定量的抗坏血酸使SSPS-Fe(Ⅲ)更好地消化吸收。
(2)对SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS的抗氧化活性的研究表明，SSPS与铁配合后，对羟基自由基、亚硝酸盐的清除活性及对脂质抗氧化的活性均比SSPS好，因此，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物有望成为一种具有多种生物活性的新型补铁剂或强化铁的食品添加剂。
［1］ Kannan R R R，Arumugam R，Anantharaman P．In vitro antioxidant activitiesofethanolextractfrom Enhalus acoroides(L F)［J］．Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2010，3(11):898 －901．
［2］ Sun Ting，Powers J R，Tang Juming．Evaluation of the antioxidant activity of asparagus，broccoli and their juices［J］．Food Chemistry，2007(105):101 －106．
［3］ Ozsoy N，Yilmaz T，Kurt O，et al．In vitro antioxidant activity of Amaranthus ividus L［J］．Food Chemistry，2009(116):867－872．
［4］ Lai Furao，Wen Qibiao，Li Lin，et al．Antioxidant activities of water-soluble polysaccharide extracted from mung bean(Vigna radiate L．)hull with ultrasonic assisted treatment［J］．Carbohydrate Polymers，2010(81):323 － 329．
［5］ Zora K，Jaromír L，Alena H，et al．Determination of antioxidant activity and antioxidant content in tomato varieties and evaluation of mutual interactions between antioxidants［J］．LWT-Food Science and Technology，2011(44):1 703－1 710．
［6］ Ilhami G，Zubeyr H，Mahfuz E，et al．Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid［J］．Arabian Journal of Chemistry，2010(3):43 －53．
［7］ 许钢，张虹，庞洁，等．竹叶提取物对亚硝化反应抑制作用的研究［J］．郑州工程学院学报，2001，22(1):69－72．
［8］ 陈国庆，先宏．植物多糖类铁复合物的研究进展［J］．重庆中草药研究，2009(2):35－38，42．
［9］ 尹艳，高文宏，于淑娟，等．水溶性大豆多糖对羟基自由基的抑制作用的研究［J］．食品工业科技，2009，30(8):83－84，87．
［10］ 孙丙政，王云峰，黄聪，等．口服补铁剂及多糖铁络合物的研究进展［J］．微量元素与健康研究，2009，26(5):64－67．
［11］ 李玉贤，游志恒，褚意新．百合多糖铁复合物的合成及其铁含量的测定［J］．中国实验方剂学杂志，2010(7):47－49．
［12］ 黄家锟，蒋开年，王凤娟，等．红景天多糖铁的合成及抗缺铁性贫血作用的研究［J］．林产化学与工业，2009，29(3):58 －62．
［13］ Chen Ruizhan，Liu Zhiqiang，Zhao Jimin，et al．Antioxidant and immunobiological activity of water-soluble polysaccharide fractions purified from Acanthopanax senticosu［J］．Food Chemistry，2011(127):434–440．
［14］ 展锐，库尔班，苟萍，等．火绒草提取物抗氧化活性的研究［J］．食品科学，2010，31(3):153－159．
［15］ 沈蔚，任晓婷，张建，等．芦根多糖的提取及其抗氧化活性的研究［J］．时珍国医国药，2010，21(5):1 078－1 080．
