饮料中肠杆菌科细菌污染情况分析*

王洋，周帼萍

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉，430023)

肠杆菌科微生物为革兰氏阴性无芽孢杆菌，需氧或兼性厌氧，广泛分布于环境中。据细菌学新的分类，肠杆菌科包括肠道病原性和非病原性的埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、变形菌属(Proteus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、沙雷氏菌属(Serratia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)等41 个菌属［1］。

由于其分布广泛，能快速厌氧发酵糖类，产酸产气，所以一旦污染到饮料产品中会迅速生长，导致发生涨罐、变酸、变味、混浊等现象。尽管该类细菌都是不耐热的，但是实际生产中经常发现有该科微生物的污染，特别是冷灌装产品中很常见。现就近3年发生的5个案例中肠杆菌科细菌的污染情况进行分析，希望对预防和排查类似污染起到参考作用。

1 材料与方法

1.1 样品

2009－2011年数家饮料生产企业送检的5种不同变质样品。案例1:2009年9月河南某企业送检PET瓶装绿茶样品(冷灌装);案例2:2010年8月湖北某企业送检的利乐包装复原乳饮料样品(热灌装);案例3:2010年9月北京某企业PET瓶装绿茶饮料(冷灌装);案例4:2011年5月湖北省某企业送检PET瓶装奶茶样品(冷灌装);案例5:2011年4月湖北省某企业送检PET瓶装蜜橘饮料(冷灌装)。

1.2 培养基

平板计数琼脂(PCA);孟加拉红培养基(虎红培养基);伊红美兰琼脂(EMB)。

1.3 材料

PCR 主要试剂如:PCR Buffer、Mg2+、Taq酶和Goldview荧光染料为TaKaRa产品，OMEGA bio-tek PCR及酶反应产物纯化试剂盒。

1.4 仪器设备

英国 TECHNE TC-312 PCR仪;上海三申(YM50AI)全自动灭菌锅;苏净安泰SW-CJ-1FD无菌操作台;DYY8B型稳压电泳仪，北京市六一仪器厂;SYNGENE凝胶图像分析系统;上海安亭TGL-16C离心机。

1.5 实验方法

1.5.1 样品中微生物的检测与计数［2］

采用平板菌落计数法，在PCA培养基上进行样品中细菌总数的测定。在37℃培养1 d后计数，并进行单菌落的分离和纯化。

1.5.2 分离菌株的 16S rDNA［3］和rpoB序列分析［4－6］

菌裂解液的制备:挑取纯化单菌落，加入装有50 μL无菌去离子水的PCR管中，混匀，PCR仪上94℃保温10 min裂解，12 000 r/min离心5 min，将上清液转入微量离心管内，制成菌裂解液，4℃保存。

PCR体系和条件:50 μL PCR体系:Taq酶0.25μL;10x PCR Buffer 5 μL;Mg2+3 μL;2.5 mmol/L 的dNTP 4 μL;2 个10 mmol/L 引物各1 μL;菌裂解液模板 5 μL;无菌去离子水 33.75 μL。

16S rDNA通用引物27F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG和804R-CTACCAGGGTATCTAATC;PCR条件为:94℃裂解5 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 60 s(27F-804R)，循环35 次;72℃ 7 min。

rpoB引物rpoB-F-CAGTTCCGCGTTGGCCT和rpoB-R-CCTGAACAACACGCTCGGA;PCR条件:94℃裂解 5 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 70 s，循环 30次;72℃ 7 min。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，Goldview染色，凝胶成像分析仪观察PCR扩增结果。

PCR产物的纯化和测序:采用OMEGA bio-tek PCR及酶反应产物纯化试剂盒，按操作说明书纯化PCR产物，送上海生工生物工程有限公司测序。

序列比对:在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行BLASTN比对。

2 实验结果

2.1 样品的理化指标

样品均有均匀混浊、产气、胀瓶/袋现象，pH值有所下降。微生物检测指标见表1。

表1 5个案例中变质样品的微生物指标

2.2 污染菌的培养特性与显微形态分析［7］

5个案例中共分离出11个菌株，具有相似的特征，即在EMB培养基上生长良好，24 h即可形成菌落，菌落浅粉色、紫色;在PCA培养基上生长迅速，24 h形成白色、黄色、微黄色，半透明、湿润、光滑的小菌落。显微观察他们的形态为单个、分散的杆菌，长短不一，见图1、图2、图3和图4。

2.3 分子生物学鉴定结果

图1 案例1中的污染菌

图2 案例4中的污染菌(阴沟肠杆菌)

图3 案例5中污染菌(阴沟肠杆菌)

图4 案例5中的污染菌(阴沟肠杆菌)

5个案例中分离的主要污染菌11株经过16S rDNA测序比对后，与肠杆菌科微生物序列相似度最高，Max Identity达99% ～100%，鉴定为肠杆菌科Enterobacteriaceae细菌。其中案例4中1个分离株和案例5中的2个分离株进行了进一步的rpoB基因PCR扩增、测序、BLASTN序列分析，两者都与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)细菌的rDNA序列相似性达99%，被进一步鉴定为阴沟肠杆菌(E.cloacae)。

2.4 生产线排查结果

因为肠杆菌科细菌不耐热，所以它们在饮料工业中的污染来自于杀菌后的二次污染，而且食品工业中肠杆菌科污染源头多数与水有关。结合微生物分析结果，对生产线排查发现，案例1的污染来自少量水(非无菌水)渗漏到无菌灌装线的无菌空气过滤器中，由无菌空气将水中的细菌带入成品中。案例2是因为机器老化，包装的封口温度过高，可能引起包装出现细小裂隙，由冷却水带入成品。案例3中除了肠杆菌污染以外，还发现了芽孢杆菌和少量霉菌的污染。因为霉菌菌相组成为:枝孢霉、交链孢霉、青霉、毛霉等，和空气中霉菌的菌相高度一致，推测污染源为空气，通过更换空气过滤器也解决了污染［8］。案例4发现，问题产品虽然检测时气密型正常，但是包材表面有划伤，污染样品中也分离到少量霉菌:曲霉和青霉为主。推测可能是灌装时出现细小、短暂的裂隙，空气污染导致的。案例5，是新灌装生产线的部分灌装头存在不畅和渗漏导致污染。

3 结果与讨论

目前16S rDNA序列比对已被广泛用于细菌鉴定分类，但由于该基因的保守性，在某些物种如:肠杆菌科中不能准确鉴定到种和属［4］。但是肠杆菌科中包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属、克罗诺属(Cronobactergen.nov.，原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii)、变形菌属和埃希氏属等有许多常见的食源性致病菌，对食品安全影响很大，实际工作中希望能进一步鉴定。此时，结合其他持家基因的分析就非常重要，如:rpoB或dnaJ。

编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因目前已成为系统发育分析和细菌鉴定的核心基因候选者，尤其是在研究亲缘关系很近的菌株时。与16S rDNA基因分析相结合，rpoB基因序列分析有助于定义细菌的新种，完善细菌群落分析，同时可以监控利福平抗性突变［4－6］。通过16S rDNA序列分析，案例4中1个分离株和案例5中分离的2个菌株是肠杆菌科细菌，再通过rpoB序列分析就准确鉴定到种—阴沟肠杆菌(E.cloacae)。

阴沟肠杆菌属肠杆菌属，为需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。肠杆菌属肠杆菌是最常见的环境菌群，但不是肠道常居菌群，是条件致病菌。阴沟肠杆菌是最常见的条件致病菌之一，常可从临床标本中分离到，如泌尿道、呼吸道和伤口感染有关，阴沟肠杆菌导致食物中毒也曾有报道［9－11］。

肠杆菌科微生物广泛存在于水、土壤等外界环境中，因此在饮料加工中很容易被污染，因其不耐热，所以在饮料灭菌时无法存活，成品中检出肠杆菌科微生物，来自于灭菌后加工过程的二次污染［10］。肠杆菌属细菌经常会污染到食品中，在小作坊式生产过程中，一般是来自与操作工人手的直接接触，特别是在从业人员未做好必要的个人卫生时。考虑到大企业的正常饮料生产中一般操作工人不会与物料发生直接接触，水源的污染是可能性最大的污染途径。这5个案例中3个的污染源头都是水，只有案例3和4是个例外，污染菌来自车间内湿润的空气。

近来由于无菌冷灌装产品的包材成本低、颜色浅、风味好、营养物质损失少，所以受到饮料行业的青睐。但是，低温灌装环节一旦出现任何问题都可能导致大批产品污染，最常见的是肠杆菌和芽孢杆菌类的污染问题。芽孢杆菌因为耐热而在杀菌后残留。而肠杆菌细菌污染，来自杀菌后二次污染，污染源可能来自水和空气。这两者均具有良好的流动性和渗透性，而且在生产线上无处不在，一旦灌装设备或包材出现哪怕是短暂的细小裂隙都会带入细菌，非常难以防范和排查。而该类微生物多数是条件致病菌，需要重视其对食品安全的影响。

［1］ Garrity G M．Bergey＇s Manual of Systematic Bacteriology［M］.(2版)．New York:Springer，2001．

［2］ GB 4789.12—2010.食品微生物学检验:菌落总数测定［S］．

［3］ 李世东，肖云，刘志国，等.1例奶茶中污染菌的分析鉴定［J］．中国酿造，2010，223(10):188 －190．

［4］ Mollet C，Drancourt M，Raoult D.rpoB sequence analysis as a novel basis for bacterial identification［J］．Mol Microbiol，1997，26(5):1 005 － 1 011．

［5］ Stoop B，Lehner A，Iversen C，et al．Development and evaluation ofrpoB based PCR systems to differentiate the six proposed species within the genus Cronobacter［J］．Int J Food Microbiol，2009，36(2):165 －168．

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［7］ 沈萍，范秀容，李广武.微生物学试验［M］．3版．北京:高等教育出版社，1999:44－46．

［8］ 王洋，周帼萍.一例茶饮料污染源分析［J］．食品与发酵工业，2011，37(5):230 －233．

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［10］ 李苏英．一起由阴沟肠杆菌引起食物中毒的实验室检测［J］．现代预防医学，2007，34(18):3507 －3509．

［11］ 张耘.一起阴沟肠杆菌引起的食物中毒调查［J］．上海预防医学，2011，23(2):62．