EL ISPOT检测人乳头瘤病毒特异性的记忆T细胞

王雪莲,卢 岩,安春丽

(1.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室,辽宁沈阳 110001;2.中国医科大学附属盛京医院院感科,辽宁沈阳 110004)

人乳头瘤病毒(human papillamavirus,HPV)是一组嗜上皮组织的双链DNA病毒。HPV仅感染局部的皮肤和黏膜上皮细胞,不入血,因而外周血中抗原特异性T淋巴细胞的数量少,抗原特异性记忆T细胞的数量更少。本研究收集HPV自发清除者(病毒清除后74个月)外周血单个核细胞,抗原肽刺激后,采用EL ISPOT方法,检测记忆T细胞分泌IFN-γ的能力,以明确外周血中记忆T细胞的数量和功能。该结果可为后续检测HPV持续感染者或宫颈癌患者体内抗原特异性的记忆T细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RPM I1640培养基、人血清、Ficoll淋巴细胞分离液购自Fisher公司;Multiscreen 96孔板购自美国Millipore公司; IL-2、IFN-γ单克隆抗体和生物素标记的Anti-IFN-γ单克隆抗体购自瑞典Mabtech公司;avidin-bound biotinylated horseradish peroxidase购自Vector Laboratories公司;EL ISPOT分析仪为Cell Technology公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC细胞的分离 HPV自发清除后74个月收集静脉血40 mL,Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),计数冻存。

1.2.2 抗原肽刺激PBMC,体外培养 前期实验已经证实此病毒自发清除者体内存在HPV16 E6 133-142表位特异性T细胞[1]。冻存的PBMC常规复苏,检测细胞活性,用含10%人血清的RPM I 1640培养基(RP-10H)过夜培养细胞(浓度为2×106/mL)。收集后计数细胞,将细胞以1×106/mL/孔置于24孔板中,应用抗原肽(HPV16 E6 133-142;10μmol/L)刺激PBMC细胞,置37℃培养箱中培养。第3天,每孔加 IL-2(1 800 U/mL)。第7天,每孔加含 IL-2的RP-10H 1 mL。第10天,收集细胞,用RP-10H洗涤细胞,去除抗原肽和 IL-2,RP-10H继续培养细胞。第11天,细胞计数后进行EL ISPOT实验。

1.2.3 EL ISPOT检测表位特异性记忆T细胞应用EL ISPOT方法,以EBV转化的B淋巴母细胞系[2](lymphoblastoid cell line,LCL)作为抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APC),以HPV16 E6 133-142为抗原,检测未经抗原刺激的PBMC和经抗原刺激11 d的PBMC中分泌产生IFN-γ的抗原特异性T细胞,同时设置阳性和阴性对照。EL ISPOT步骤参考文献[1]。用IFN-γ单克隆抗体(5μg/mL)包被Multiscreen 96孔板,4℃冰箱中过夜。次日弃包被液,PBS洗3次。用含5%人血清的RPM I 1640培养基(RP-5H;50μL/孔)37℃封闭2 h。每孔加入50μL LCL细胞(5×105/孔)、50μL PBMC(5×104/孔),50μL HPV E6 133-142(10μmol/L),实验设阳性(PHA)和阴性对照(RP-5H)。每一条件设3个平行孔。平板置37℃细胞培养箱中过夜。PBS洗3次后,加入生物素标记的Anti-IFN-γ单克隆抗体(1μg/mL),37℃孵育2 h。PBS洗3次后,加入avidinbound biotinylated horseradish peroxidase,37℃孵育1 h。PBS洗3次后,diaminobenzene显色。去离子水终止显色。EL ISPOT分析仪计数斑点数量。计算每一条件斑点数量的平均值作图。

2 结果与分析

2.1 细胞计数

常规复苏PBMC,过夜培养后,计数细胞,活细胞数为4.1×105,抗原肽刺激10 d后,细胞数增加为4.2×106,为抗原刺激前细胞数的10.2倍。第11天,细胞数为4.65×106,为抗原刺激前细胞数的11.3倍。

2.2 EL ISPOT检测PBMC中的记忆T细胞

图1 EL ISPOT检测经抗原刺激的PB MC中HPV特异性的T细胞Fig.1 HPV-specific T cells in antigen-stimulated PBMC by EL ISPOT

EL ISPOT结果显示,PBMC中的记忆T细胞经抗原刺激后活化为效应细胞,能够识别APC递呈的抗原肽HPV16 E6 133-142,并分泌IFN-γ(图1)。而未经抗原刺激的PBMC不能识别APC递呈的抗原肽(图2)。通过计数斑点数量,推算PBMC中抗原特异性的记忆T细胞的频数。公式如下:记忆T细胞的频数=(计数抗原肽刺激孔斑点数量-阴性对照孔斑点数量)÷PBMC数量÷细胞增加倍数。此HPV自发清除者外周血中抗原特异性的记忆T细胞的频数为(69-30)÷(5×104)÷11.3=0.007%。

图2 EL ISPOT检测未经抗原刺激的PBMC中HPV特异性的T细胞Fig.2 HPV-specific T cells in antigen-unstimulated PBMC by EL ISPOT

3 讨 论

机体内的初始T细胞识别抗原递呈细胞递呈的抗原后,可被激活,分化为效应T细胞[3]。当机体清除抗原,效应细胞中的一部分可分化转为记忆T细胞。当再次接触相同抗原时,抗原特异性的记忆T细胞可迅速增殖分化为效应T细胞[4-5]。相较于初始T细胞,记忆T细胞具有较低的活化阈值和较强的效应功能。因此在防止病原菌的再感染过程中,记忆T细胞反应迅速,功能强大,发挥重要作用[6]。

体外抗原刺激可活化PBMC中的记忆T细胞[7-8]。本实验采用已经鉴定的表位肽HPV16 E6133-142[1]刺激HPV自发清除者(HPV清除后74个月)的PBMC,使其中的记忆T细胞增殖分化为效应细胞。通过细胞计数,发现抗原刺激11 d后,细胞数量增加11.3倍,表明PBMC中含有HPV16 E6133-142特异性的记忆T细胞,此T细胞经特异性抗原肽激活后,分化为效应细胞,细胞分裂增殖,数量增加。

EL ISPOT可以从100万个细胞中检测出单个分泌细胞,具有较高的可靠性、重复性及敏感性。本研究应用EL ISPOT方法检测活化的记忆T细胞中分泌IFN-γ的T细胞的数量,来推算PBMC中抗原特异性的记忆T细胞的数量。经计算,此HPV自发清除者(病毒清除后74个月)外周血中抗原特异性的记忆T细胞的频率约为0.007%。本研究结果为进一步疫苗设计提供重要的理论依据。

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