有机物料腐熟剂中纤维素酶活力测定方法的验证

吴红艳,王智学,陈 飞,郭玲玲,修翠娟

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁朝阳 122000)

纤维素是所有植物的主要组分,由于纤维素中存在很多高能的氢键,因此其水解、利用困难,大部分难以被人类或动物所直接利用。有机物料腐熟剂是一种能加速各种有机物料(包括农作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等)分解、腐熟的微生物活体制剂[1],其中含有数量较多的可以产生纤维素酶的微生物。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异,同时纤维素酶作用的底物也比较复杂,致使纤维素酶活力的测定方法很多,且方法复杂而不统一。常用的方法有CMC糖化力法、CMC液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。国内许多学者分别采用了以上各种方法[2]并进行了种种修改,这不仅使得纤维素酶活力测定的方法多样化,也造成了不同产品、不同结果之间无法相互比较。在上述测定方法中,CMC糖化力主要代表外切β-1,4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和[3],在研究和实际生产中应用比较普遍。为了测定此有机物料腐熟剂中纤维素酶的活力,制定科学的检测依据,本文对所采用的方法(即改进后的CMC糖化力测定法[4])进行了验证,使采用的方法适合于相应检测要求。验证的主要内容[5]:准确度(加样回收率)、线性(线性回归方程)、精密度和重复性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 有机物料腐熟剂由辽宁省微生物科学研究院提供。

1.1.2 试剂 3,5-二硝基水杨酸(DNS)、羧甲基纤维素钠(CMC)、葡萄糖、醋酸钠、醋酸,均为分析纯。

1.1.1 仪器 723型分光光度计,恒温水浴锅,万分之一分析天平,具塞刻度试管,移液管等。

1.2 方法

1.2.1 原理[6]纤维素酶能促使纤维素断裂成低聚纤维素,直至分解成寡糖和单糖。利用一定条件下单位时间内羧甲基纤维素钠在酶的作用下,生成还原糖的量来表示纤维素酶的活力。还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)发生颜色反应,因此,可利用分光光度计进行比色,测定出其活力。酶活力定义:1 g固体样品,在50℃、pH 4.4的条件下,1 min内分解羧甲基纤维素钠产生1 μg葡萄糖,即为1个酶活力单位,以u/g表示。

1.2.2 溶液配制 ①0.1%标准葡萄糖溶液:精确称取已恒重的葡萄糖0.1 g,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中;②0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.4):甲液(0.1 mol/L醋酸钠溶液):精确称取0.42 g醋酸钠溶于50 mL蒸馏水中;乙液(0.1 mol/L醋酸溶液):吸取2 mL醋酸溶液用水稀释至120 mL。取甲液39 mL,乙液61 mL混合即可;③3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS显色剂):称取6.3 g 3,5-二硝基水杨酸溶解于蒸馏水中,加入20 g氢氧化钠、182 g酒石酸甲钠,加蒸馏水500 mL升温溶解后加入重蒸酚4 g,无水亚硫酸钠3 g,加热搅拌待全部溶解后冷却,定容至1 000 mL,过滤、贮存于棕色瓶中放置7～15 d后使用;④0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)配制:称取0.500 0 g羧甲基纤维素钠溶解于100 mL的0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.4)中,4℃冰箱保存,用前充分摇匀。

1.2.3 供试液制备 精确称取样品2～3 g,加入适量的0.1 mol/L醋酸缓冲液,搅拌均匀,于30℃恒温振荡提取60 min,8 000 r/min低温离心10 min,收集上清液,再重复1次,合并上清液即为待测样品溶液。测定时稀释至适当倍数。

1.2.4 方法验证 ①线性关系考察:按表1在比色管中分别加入0.1%标准葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,均用蒸馏水补足0.5 mL,各加入DNS显色剂3 mL,在沸水浴中显色10 min,放入冷水中冷却,定容至10 mL,用10 mm比色皿、波长550 nm,分别测定其吸光度,以不含葡萄糖的1号管为空白。以葡萄糖毫克数为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线考察其线性关系,结果见表1;②准确度(加样回收率)试验:精密称取已知含量的纤维素酶100 mg,置100 mL容量瓶中,加适量0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.4)使其完全溶解后定容,作为对照液。加入已知含量的样品中,使其浓度分别达到其含量的80%、100%、120%,然后用纤维素酶活力测定方法,测定计算回收率,结果见表2;③重复性试验:分别称取5份样品2～3 g,加入0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.4)溶解并定溶至100 mL,依法测定其含量,结果见表3;④精密度试验:分别配制高、中、低3个浓度的纤维素酶供试液,各浓度连续测定3次,计算方法的精密度,结果见表4。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察结果

线性关系考察结果见表1。以葡萄糖毫克数为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,并得出回归方程:y=1.562 6x-0.018 1。回归线的相关系数R=0.999 0,R值大于0.998。

表1 标准曲线试验结果Table 1 The test result of standard curve

2.2 准确度(加样回收率)试验结果

准确度(加样回收率)试验结果见表2。测得各样品平均加样回收率为98.29%,RSD%=0.513 3%(n=9),小于2.0%。

表2 准确度(加样回收率)试验结果Table 2 The test result of accuracy(recovery of adding sample)

2.3 重复性试验结果

重复性试验结果见表3。测得样品之间相对标准偏差为0.54%(n=6),小于2.0%。

表3 重复性试验结果Table 3 The test result of repeatability

2.4 精密度试验结果

精密度试验结果见表4。测得样品之间相对标准偏差为0.39%(n=6),小于2.0%。

表4 精密度试验结果Table 4 The test result of precision

3 讨 论

由本实验验证结果可以看出,回归线的相关系数R=0.999 0大于可接受标准0.998,证明线性关系良好。准确度(加样回收率)的平均加样回收率为98.29%,RSD%=0.513 3%(n=9)均符合标准,即各浓度下的平均回收率均应在98.0%～102.0%之间,9个回收率数据的相对标准差(RSD)不大于2.0%。重复性试验和精密度试验结果表明,RSD%均小于2%,符合标准。

因此,本测定方法稳定、可靠,可以作为有机物料腐熟剂中纤维素酶活力的测定方法。

[1] 中华人民共和国农业部发布的中华人民共和国农业行业标准提出《有机物料腐熟剂纤维素酶活力测定》[M].2005.

[2] 孔新刚,李华,吴国莲.秸秆纤维素酶水解率测定方法的研究[J].新疆农业科学,2007,44(5):663-666.

[3] 顾方媛,陈朝银.纤维素酶的研究进展与发展趋势[J].微生物学杂志,2008,28(1):83-87.

[4] 张庆华,赵新海,李莉,等.秸秆降解菌的筛选及模拟田间应用效果分析[J].微生物学杂志,2010,30(4):101-104.

[5] 丁恩峰,高海燕,韩志伟.顶空气相色谱法测定原料药中正丁醇和乙酸乙酯含量的方法验证[J].医药工程设计,2006,27(4):30-32.

[6] 顾赛红,赵志辉,陈海燕,等.底物和酶液稀释对黑曲霉纤维素酶活性测定的影响[J].中国饲料,2006,(7):9-12.