结核分枝杆菌Ag85A口服脂质体DNA疫苗安全性的初步验证

姜燕

(沈阳大学生物与环境工程学院，辽宁沈阳110044)

DNA疫苗的安全性是人们关心的重要问题。一个最重要的理论危机是质粒DNA与宿主基因组整合的问题，因为当外源DNA与基因组整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，从而导致肿瘤细胞形成。因此DNA疫苗可否与染色体整合仍是有争议的焦点问题［1-2］，迫切需要开展疫苗佐剂和接种设备的安全性评价［3］，实验中以既往的实验为基础，构建了脂质体pcDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗，由于经免疫组化及间接免疫荧光方法均检测出Ag85A基因的表达产物广泛分布于脾、小肠组织［4］，处死免疫动物后，取质粒存在最丰富的2个部位，即脾、小肠，提取基因组中DNA，并以此为模板进行PCR的扩增。主要从基因整合方面进行了初步探讨，即观察以pcDNA3.1+/Ag85A对小鼠进行免疫后，重组体DNA即pcDNA3.1+/Ag85A可否与小鼠的染色体基因组发生整合，对此疫苗的安全性进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物C57BL/6小鼠，6～8周龄，雄性，由上海中国科学院动物所提供。

1.1.2 重组口服pcDNA3.1+/Ag85A疫苗pcDNA3.1+/Ag85A口服阳离子脂质体DNA疫苗由本实验室构建［5］，根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板，经过PCR扩增出Ag85A目的基因，纯化PCR产物TA克隆入载体pUCm-T，蓝白斑筛选将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶XhoⅠ和BamHⅠ双酶酶切后，经T4 DNA连接酶作用，与真核表达载体pcDNA3.1+连接，筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定，如经证实为Ag85A基因，克隆到载体pcDNA3.1+中的CMV启动子的下游，成功构建并鉴定的真核表达载体pcDNA3.1+携带Ag85A基因的重组体，命名为pcDNA3.1+/Ag85A，将其转化大肠埃希菌并使之大量扩增，并采用无内毒素提取质粒方法收集此重组质粒DNA，以阳离子脂质体为运载体，制成可供口服的DNA疫苗。

1.1.3 仪器设备UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物口服免疫接种雄性小鼠随机分成2组，1组口服生理盐水做对照，另1组口服脂质体pcDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗，C57 BL/6小鼠12只，雄性，随机分为2组，每组6只，NS-生理盐水组;L+JA-脂质体包裹的重组质粒组，经口灌饲100 μg重组质粒pcDNA3.1+/Ag85A共免疫3次，每次间隔2周。

1.2.2 脾脏、小肠基因组DNA抽提末次免疫后7 d收集各组免疫小鼠的血清及脾脏、小肠组织。①组织匀浆制备:分别取30 mg脾及小肠组织，加600 μL TE缓冲液，手工匀浆数次;②细胞裂解:吸取300 μL匀浆加600 μL细胞裂解液，混匀;③消化蛋白:再加入9 μL蛋白激酶K混匀，置于55℃水浴30 min以上，其间上下混匀几次;④氯仿抽提:加入600 μL氯仿，轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性;⑤沉淀:在台式离心机上，10 000 r/min，室温离心2 min。此时应分成3层，基因组DNA在上层中。取500 μL上清液，置于无菌1.5 mL离心管中，加入500 μL沉淀液，混匀多次至出现絮状物，室温静置2 min。10 000 r/min，离心2 min;⑥去除RNA:弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 μL 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 μL RNase A，置于37℃10 min，以去除RNA;⑦沉淀DNA:加入300 μL冰冷乙醇(终浓度为75%，沉淀效果最佳)，－20℃放置10 min。10 000 r/min，离心2 min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15 min。DNA用TE缓冲液或100 μL三蒸水溶解。

1.2.3 引物设计根据GenBank中Ag85A基因序列，PCR所用引物:上游引物5'-CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC-3'，含BamHⅠ酶切位点;下游引物5'-GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3'含XhoⅠ酶切位点，并在ORF终止密码子之后。Ag85A含信号肽序列。确保克隆基因开放读码框正确。

1.2.4 重组质粒整合情况检测以基因组核酸为模板做PCR，每次实验设一阳性对照管，其模板为1 μg Ag85A质粒核酸，所有PCR反应管除模板不同外，其余完全相同，94℃预变性15 min，热启动后转入94℃变性1 min，60℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，进行30个循环，72℃延伸10 min后终止反应。反应结束后取5 μL产物于1%琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增出目标核酸片段。

2 结果与分析

2.1 一般症状

受试动物实验组与对照组之间，受试期与恢复期之间体重、食量、一般活动等方面分别比较均未见明显改变。疫苗口服免疫后，小鼠无明显不良反应，初步提示了口服疫苗的安全性。

2.2 脏器重量

受试小鼠脏器重量与对照组相比，P＞0.05，均无明显差异，见表1。表明本疫苗对受试动物的脏器重量未产生与药物相关的影响。

表1 受试小鼠脏器重量与对照组相比的实验结果Table 1 organ weights of mice between the experimental group and control group

2.3 基因组DNA与重组体整合情况的PCR检测(图1)

所有小鼠的全部受检组织内PCR检测均为阴性。提示初次免疫后7周质粒DNA并未与基因组DNA发生整合，间接说明质粒DNA整合到宿主细胞基因组并使细胞发生恶性转化的可能性很小。

图1 重组体pcDNA3.1+/Ag85A与口服免疫小鼠脾、肠组织基因组DNA整合情况分析Fig.1 The analysis of integration possibility of pcDNA3.1+/Ag85A and spleen，intestine genome respectively

M:分子量标准;1:免疫小鼠基因组DNA;2:为PCR扩增阳性对照组(1 100 bp)-Ag85A基因;3:生理盐水阴性对照组脾脏提取物与基因组DNA的整合;4:免疫小鼠脾脏基因组DNA与重组体pcDNA3.1+/Ag85A的整合情况;5:生理盐水阴性对照组小肠提取物与基因组DNA的整合;6:免疫小鼠小肠基因组DNA与重组体pcDNA3.1+/Ag85A的整合情况

3 讨论

目前DNA疫苗研究取得了重大进展，DNA疫苗运用到动物模型上已经取得了较好的效果，而且几乎在所有的动物试验上并未发现有任何副作用。但还有很多问题需要解决，如疫苗的质量控制、质量标准及安全性等。其中最为重要的是安全性问题［6］，即将开展以下几个方面研究:①质粒DNA可能诱导自身免疫反应:尽管人和动物的许多试验表明质粒DNA诱发自身免疫性疾病的可能性较小，而且目前已有一项DNA疫苗的接种研究表明，免疫动物血清中未检测到抗DNA抗体，但在DNA疫苗试验时，仍应进行抗DNA抗体的检测［7］;②持续表达外源抗原可能产生一些不良后果:质粒长期过高水平地表达外源抗原，可能导致机体对该抗原的免疫耐受或麻醉。成年动物尚未见到因DNA疫苗接种而诱发免疫耐受的例子。但新生动物的免疫系统尚未成熟，可能将外源抗原认为是自身成分而形成耐受。另外，持续低水平表达的抗原可能会被血中的中和抗体清除，不能引起足够的免疫应答，从而使疫苗的预防作用得不到充分的体现［8］。

实验结果显示质粒重组体并未与基因组DNA整合，间接说明pcDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗对免疫动物并没有潜在的致癌作用，同时受试动物实验组与对照组之间，不论受试期还是恢复期之间体重、食量、一般活动等方面未见明显改变。受试小鼠脏器重量(相对重量和绝对重量)与对照组相比，无明显差别。表明本疫苗对受试动物的脏器重量未产生与药物相关的影响［13］。重组DNA疫苗不存在与宿主染色体基因组DNA发生整合诱生肿瘤细胞的危险，为DNA疫苗安全性及应用奠定了基础。脂质体pcDNA3.1+/Ag85A DNA未与宿主基因组整合，疫苗具有良好的安全性。

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