52种热带药用植物抗烟草青枯菌的体外活性筛选

姜雯婷，戴好富，刘寿柏，梅文莉*

(1.海南大学环境与植物保护学院，海南海口571737;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海南海口571101;3.海口市热带天然产物研究与利用重点实验室，海南海口571101)

烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的烟草一大毁灭性病害。该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区，在我国烟草产区普遍发生，局部地区发病严重［1］。青枯菌寄主范围广泛，可侵染54个科的450余种植物［2］。烟草青枯病的防治长期依赖化学防治，病原易产生抗药性，故防效不明显，化学药剂的毒性强，对环境危害严重，且影响着烟叶的产量，是烟叶生产可持续发展中亟待解决的关键问题，所以寻找有效防治青枯病的技术与方法，是当今植物病理学研究的重要课题之一［3-4］。从植物中寻找对有害生物有抑制活性或杀伤作用的物质是开发新农药的一个主要方法［5］。海南岛药用植物资源丰富，有维管束植物4 500多种，药用植物3 100多种，其中特有的黎族药近800种［6-7］，为寻找具有抗烟草青枯菌活性的热带药用植物提供了物质基础。本实验运用滤纸片法和2倍稀释法，对52种热带药用植物的乙醇提取物进行烟草青枯菌的抑菌活性筛选，旨在寻找具有抗烟草青枯病活性的药用植物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料共采集了52种热带药用植物，分属于31科47属(表1)，主要采自海南海口、儋州、昌江等地。植物样品由中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定，凭证标本现存于热带生物技术研究所。

表1 供试热带药用植物样品Table 1 Samples of tropical medicinal plants tested

1.1.2 供试菌株烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)由云南大学生物资源保护与利用重点实验室莫明和教授提供。

1.1.3 培养基［8］牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基(NA培养基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，水1 000 mL，调pH值至7.4～7.6，固体培养基:琼脂20 g。

1.1.4 试剂甲醇、乙醇、氯化钠均为分析纯，购自广州化学试剂厂;牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为生物化学试剂，购自广州环凯微生物科技有限公司。

1.1.5 仪器HVE-50高压蒸汽灭菌锅，日本HIRAYAMA公司;SW-40洁净工作台，上海博迅实业有限公司;ZD-8802D摇床，太仓市华利达实验设备有限公司;Q/BKYY31-2000电恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂;HHB11360-S普通培养箱，上海跃进医疗器械厂;Delta 320-S pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 样品和药液的制备［9］样品采集后自然晾干后，粉碎;用乙醇冷浸提取3次，分别浸提7、7、5 d，提取液合并在50℃下减压浓缩至干，获乙醇提取物。浓缩干燥后所得的浸膏用甲醇定容为质量浓度100 mg/mL的溶液，置于4℃保存备用。

1.2.2 菌悬液制备［10］将烟草青枯菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于30℃恒温箱中培养24 h，用接种环将菌株转移至装有液体培养基三角瓶中，30℃恒温摇床中培养24 h，振动频率250 r/min。加入无菌生理水，稀释成浓度为106个/mL的菌液。

1.2.3 抑菌试验［11-12］采用滤纸片法进行测定。在营养琼胶培养基平板上加入100 μL细菌悬浮液并涂布均匀。取样品溶液10 μL，滴加到直径6 mm的灭菌滤纸片上，风干，制成含提取物干质量剂量为1 mg的含药滤纸片。然后用无菌镊子夹取将含药滤纸片倒置贴于细菌营养平板上，并轻轻按压使充分接触，每个平板5片，每处理重复3次。中间以相同剂量的甲醇溶液为对照。置30℃恒温培养箱培养24 h后用十字交叉法测量抑菌圈直径，求平均值。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定［13-14］对于抑菌效果明显的提取物，采用2倍稀释法，从质量浓度100 mg/mL开始依次浓度减半，设置浓度梯度对烟草青枯菌进行作用，浓度梯度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.31、1.56 mg/mL，从而测定最低抑菌浓度(MIC)。在无菌条件下，按照前面的抑菌试验方法进行，以刚好出现抑菌圈的浓度值作为最低抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小测定结果

本试验一共测试了52种热带药用植物对烟草青枯菌的抑菌作用，活性结果见表2。共有13种药用植物显示抑菌活性，抑菌圈大小依次为光叶巴豆＞酒饼簕＞簕欓花椒＞许树=大管＞荔枝草＞光叶紫玉盘＞牛筋果=白榄树＞细基丸＞钩枝藤＞蜂巢草=长春花。其中光叶巴豆的活性最强，抑菌圈直径为12 mm;抑菌圈直径＞8 mm的热带药用植物有6种，分别为酒饼簕、簕欓花椒、许树、大管、荔枝草和光叶紫玉盘。这13种热带药用植物分别属于9科13属，表现了抗菌植物的多样性。

表2 13种热带药用植物乙醇提取物对烟草青枯菌的抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone of ethanol effects from 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定结果

利用2倍稀释法测定13种热带药用植物抗烟草青枯病原菌的最小抑菌浓度(MIC)，结果见表3。酒饼簕的最小抑菌浓度为3.31 mg/mL，光叶巴豆和许树的最小抑菌浓度均为6.25 mg/mL，表现为较强的活性。

表3 13种热带药用植物乙醇提取物对烟草青枯菌的MICTable 3 The mensuration result of MIC of 13 species of tropical medicinal plants against Ralstonia solanacearum

3 讨论

通过对52种热带药用植物抗烟草青枯菌活性的初步筛选，结果表明，共有13种药用植物显示有抗烟草青枯菌的活性，其中光叶巴豆、酒饼簕和许树的活性最强，其余呈现不同强度的抑菌活性。据郑全喜等［15］报道，植物抑菌的主要成分是各种精油、酚类、生物碱和黄酮类等物质。本实验中测定的长春花、钩枝藤中富含生物碱［16-17］，细基丸、光叶巴豆中含有黄酮［18-19］。因此，光叶巴豆、酒饼簕和许树等13种药用植物的活性大小可能与含有此类化合物有关，但不排除其他有效成分存在较强的抑菌作用可能性。同时，实验表明抑菌圈大小与其相应的MIC值不一定成平行关系，这可能是由于其提取物含有多种成分而各成分的活性强度各不相同所致［20］，因此，还需进一步跟踪、研究提取物中各成分的抑菌活性大小及抑菌机理。实验仅在室内离体测定了植物样品乙醇提取物的抑菌活性，提取物在活体上的表现如何，在田间试验中能否表现防治作用，都还有待于进一步研究。本实验对提取物的抗烟草青枯菌活性进行研究，为烟草青枯病的防治提供新的思路，

也为热带药用植物资源的开发和利用提供了科学依据。

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