两种 SPE净化测定克伦特罗等β2-受体激动剂的基质效应

王国民 彭涛 陈冬东 郗存显 李应国

(1.重庆出入境检验检疫局 重庆 400020;2.中国检验检疫科学研究院)

1 前言

β2-受体激动剂是一类人工合成药物,主要用于防治人、兽支气管哮喘及痉挛。研究发现该类药物添加到饲料中后具有营养再分配作用,可以显著提高动物的瘦肉率而曾被作为促生长添加剂受到广泛关注。由于长期使用、屠宰前期使用或滥用β2-受体激动剂,会造成其在动物组织中的大量残留,进入人体后引起肌肉振颤、心动过速、心悸和过敏等急性中毒症状[1],甚至严重影响运动能力[2]和生殖系统[3],最终产生致畸、致突变和致癌等效应。因此,世界各国已禁止β2-受体激动剂作饲料添加剂。

目前,β2-受体激动剂的主要确证方法是高效液相色谱 -串联质谱法 (LC-MS/MS)[4-7]。液相色谱 -串联质谱的定性能力强、定量测定灵敏度高,但在定量分析复杂样品中的痕量化合物时易受样品基质的干扰,且通常情况下分析物响应的抑制或增强会降低测定的精密度和准确度[8-9]。本文参照 Lian Wang[10]的样品酶解方法,即使用乙酸铵60℃酶解 2 h后提取猪肉、猪肝和鱼肉样品中的痕量沙丁胺醇、克伦特罗和特布他林方法,分别采用SN/T 1924-2007[6]和王凤美[7]所使用的 C18-SCX串联柱及 MCX固相萃取柱净化,按照 Matuszewski等[11]建立的数学模型评定考察 LC-MS/MS测定这几种β2-受体激动剂的基质效应,为定量方法的选择提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器

WatersQuattro Premier超高效液相色谱 -串联质谱仪 (美国 Waters公司);R-200型旋转蒸发仪(BÜCH I);KQ-600型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);XH-B型旋涡混匀器(江苏康健医疗用品有限公司);Z323K型离心机 (德国,HERMLE);Silentcrusher M型高速匀质器 (德国 Heidolph)。

2.1.2 主要试剂与材料

乙腈、甲醇均为 HPLC级;乙酸铵为优级纯;沙丁胺醇、盐酸克伦特罗和特布他林标准样品:纯度大于 99.0%,均购于德国 Dr.公司;其余化学试剂均为分析纯;β-盐酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液:购于 Sigma公司,混合液中含β-盐酸葡萄糖醛苷酶 94400U/mL,芳基硫酸酯酶 1079U/mL。MCX固相萃取柱:Waters Oasis,3mL,60 mg;C18固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg;SCX固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液配制

标准储备液:分别准确称取适量沙丁胺醇、盐酸克伦特罗和特布他林用甲醇溶解,配制成浓度为100μg/mL的混合标准储备液;

标准工作溶液:根据需要用流动相将标准储备液稀释成 2-100.0ng/mL的混合标准工作溶液。

2.2.2 液相色谱 -串联质谱条件

色谱柱:Phenomenex Kinetex-C182.1(i.d)×100 mm(2.6μm);

1)这次暴雨天气是南下的弱冷空气与副热带高压西北侧的暖湿空气在长江中下游交汇造成的;低空急流为暴雨输送水汽和能量,切变线为对流的发展提供低层辐合上升条件。

流动相:乙腈 +5mmol/L乙酸铵缓冲液 (含0.2%甲酸);

流速:0.2mL/min;

进样体积:10μL;

电离方式:ESI+;毛细管电压:3.5 kV;离子源温度:110℃,脱溶剂气温度:400℃;锥孔气流量(N2):50 L/h,脱溶剂气流量 (N2):600L/h,碰撞室压力 (Ar):3.6e-3(mbar),碰撞气流量 (Ar):0.3 mL/min。定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间见表 1。

表 1 待测物定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间

2.2.3 样品处理

2.2.3.1 样品提取

同时准确称取 5份匀浆后不含待测物沙丁胺醇、盐酸克伦特罗和特布他林的样品 (猪肉、鱼肉及猪肝)10.0g,参照 LianWang[10]的样品酶解方法,即分别加入 20.0mL 2.0 mol/L乙酸铵缓冲溶液 (pH 5.2),高速匀质 2 min。加入 50μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液,超声提取 15 min。在 60℃恒温箱中酶解 2 h后,以 3000 r/min离心 10 min。上清液分别作为MCX和 C18-SCX柱的待净化液。

2.2.3.2 样品净化

2.2.3.2.1 MCX柱净化

(1)依次采用 3mL甲醇、3mL水活化 MCX小柱,移取上待净化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通过MCX小柱,然后用 3mL水、3mL甲醇水 (1+1)进行淋洗,最后用 5mL 5%的氨化甲醇洗脱。

(2)洗脱液于 40℃下氮气浓缩吹干后,用 0.5mL浓度为 2ng/mL的标准混合工作溶液定容,供 UPLC-MS/MS进行提取后添加法基质效应测试。

2.2.3.2.2 C18-SCX串联柱净化

(1)将 C18和 SCX小柱串联,SCX小柱在下,依次用 5mL水、5mL甲醇及 5mL 0.03 mol/L盐酸活化,移取上待净化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通过小柱,然后用 5mL水,5mL甲醇淋洗,最后用12mL乙酸乙酯氨水 (97+3)溶液洗脱。

(2)洗脱液于 40℃下氮气浓缩吹干后,用0.5mL浓度为 2ng/mL的标准混合工作溶液定容,供UPLC-MS/MS进行提取后添加法基质效应测试。

2.2.4 基质效应评价方法

按照Matuszewski等[11]建立的数学模型评定基质效应的影响。采用提取后添加法,比较 2个不同条件下的信号峰面积平均值,其中 Sl为标准品溶液的色谱峰面积,S2为动物源性样品基质提取后添加标准溶液后的色谱峰面积,则绝对基质效应(ME%)=S2/Sl×100%。当 ME为 100%时,表明没有绝对基质效应;当ME ＞100%时,表明有信号增强;当ME ＜100%时,表明有信号抑制。

3 结果与讨论

基质是样品中被分析物以外的组分,常对分析物的分析有显著干扰 (信号增强或抑制),这种影响和干扰被称为基质效应。LC-MS/MS普遍存在基质效应[12],基质效应会影响检测方法的准确度和精密度,甚至认为[13]基质效应已成为液相色谱 -串联质谱的“致命”缺点。目前对于基质效应产生的确切机理还不太清楚,但大都认为是由于分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率。Cech[14]、King[15]等研究认为,基质效应由形成带电雾滴时非挥发性的基质组分与分析物离子竞争产生的,这些非挥发性基质组分将雾滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。因此,在用 LC-MS/MS测定时需要考察和消除基质效应[17]。一些分析工作者提出了使用基质匹配溶液、同位素标记内标溶液、优化样品前处理条件和改进液相色谱串联质谱分析条件等[18]解决基质效应的许多方法。但是,使用基质匹配溶液在操作上非常麻烦,前处理工作量大;同位素内标虽可抵消质谱离子化时的基质效应和消除样品前处理中的差异,但标记物价格昂贵且不易获取,在一般实验室很难作为常用方法,且在同时检测多个分析物时很难抵消基质效应,造成定量结果出现偏差。因此,优化样品前处理方法、纯化样品、尽可能地减少最终提取液中的基质成分是消除基质效应最为有效和彻底的方法。

3.1 MCX柱净化后的基质效应

图 1是鱼肉、猪肉和猪肝样品酶解提取液经MCX柱净化后,UPLC-MS/MS测定 CL、SAL和 TE时的绝对基质效应,可以看出,3种组织样品都存在较强的信号抑制,并且对 CL、SAL和 TE 3种目标物的信号抑制顺序均为:猪肝 ＞鱼肉 ＞猪肉。3种目标物中以 CL的信号抑制最强,对 TE和 SAL的信号抑制差异不明显。

图 1 MCX柱净化后的基质效应

3.2 C18-SCX串联柱净化后的基质效应

图 2是鱼肉、猪肉和猪肝样品酶解提取液经 C18-SCX串联柱净化后,UPLC-MS/MS测定 CL、SAL和 TE时的绝对基质效应,可以看出,3种样品都存在信号抑制。对于具体检测目标物,CL的信号抑制最强,TE的信号抑制相对较小。而对于组织样品,以鱼肉的信号抑制增强,其次是猪肉和猪肝。SAL和 TE 3种物质的信号抑制顺序相同 (鱼肉 ＞猪肉 ＞猪肝)。

图 2 C18-SCX串联柱净化后的基质效应

3.3 两种净化方法的基质效应比较及原因分析

由图 1图 2可知,采用 C18-SCX串联柱净化方法的基质效应要明显小于MCX净化方法,特别是对于目标物特布他林和沙丁胺醇,而对于克伦特罗,两种净化方法的差异不明显。对于具体组织样品,两种净化方法的基质效应表现也不一样,猪肝样品采用MCX净化的信号抑制最强,而鱼肉样品采用C18-SCX串联柱净化的信号抑制最强。产生差异的原因在于:根据 Antignac[19]等的研究,引起基质效应的干扰物质分为“内源性抑制”和“外源性抑制”物质,内源性抑制物质主要是指本来存在于样品基质中,而经过提取后仍然存在于提取物中,包括盐、高极性化合物、表面活性剂、有机分子如各种糖类、胺类、脂类、肽类,或与分析目标物化学结构接近的代谢产物;外源性抑制主要是指由样品制备及色谱分析过程中引入的干扰物,如塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、流动相等,由于猪肝、猪肉及鱼肉样品中的有机化合物如糖类、胺类、脂肪等含量有较大差异,同时 SCX属于强阳离子净化材料,而 MCX为混合阳离子净化材料,因此对样品中干扰物的去除能力也不一样。

4 结论

综上,对于同一检测目标物,采用不同的净化方法,其在UPLC-MS/MS检测中所表现的基质效应完全不同。采用目前标准方法及文献报道的MCX和 C18-SCX串联柱 SPE柱净化,均不能消除UPLC-MS/MS测定克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林的基质效应,均存在较强的信号抑制。从提高检测结果的准确性来看,两种净化方法均不能消除基质效应。因此,在样品定量时需要采用基质匹配标准溶液或同位素内标及其他净化手段来消除基质效应。

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