＊ 基于m tDNA CO I基因序列的盐肤木种群遗传变异

安淼,马恩波,任竹梅

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西大学应用生物学研究所,山西太原 030006)

＊基于m tDNA CO I基因序列的盐肤木种群遗传变异

安淼1,马恩波2,任竹梅1＊

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西大学应用生物学研究所,山西太原 030006)

基于m tDNA CO I基因序列对贵州、湖北和四川的盐肤木(Rhus chinensisM ill.)种群进行遗传变异分析.研究共测得盐肤木9个种群50个个体的m tDNA COI基因长度为1.37kb的序列,在测得的序列中有3个核苷酸位点存在变异(占所测核苷酸序列的0.22%),T、C、A、G 4种核苷酸的组成分别为34.1%、21.8%、22.5%、21.6%,其中A+T含量(56.6%)高于 G+C含量(43.4%).共检测到3个单倍型(HapA、HapB和 HapC),HapA出现在所有种群中,是出现频率最高的单倍型,占所测序列的90%,该单倍型可能是祖先单倍型;HapB由安县的1个个体和竹山的3个个体共享,而 HapC只存在于榕江的1个个体.分析表明盐肤木种群具低水平单倍型多样性(0.000 2)和核苷酸多样性(0.187 0),基于该基因序列的盐肤木种群间遗传多样性和遗传分化均较小.

盐肤木;m tDNA;CO I基因序列;遗传变异

盐肤木(Rhus chinensisM ill.)是漆树科盐肤木属落叶灌木或小乔木,主要分布于东亚温带、亚热带、热带地区,我国除黑龙江、吉林、内蒙、宁夏、青海、新疆等省(区)外均有分布[1],是形成五倍子最主要的寄主植物,又称“五倍子树”,只有贵州、四川、湖北、湖南、陕西、云南和广西等部分山区的盐肤木可见有倍子形成,是具经济价值的植物[2].目前对盐肤木叶片的化学成分、形态结构特点、人工繁殖及育苗技术、细胞生物学等已进行了相关研究[3-6],而有关盐肤木种群遗传多样性和遗传结构方面的研究较少.本课题组利用ISSR技术对角倍蚜及其寄主盐肤木的遗传结构进行了比较分析,发现角倍蚜和盐肤木种群具有相同的基因流模式,但其遗传距离不具有相关性[7].用DNA序列作为分子标记进行盐肤木种群遗传多样性方面的研究还鲜见报道.鉴于此,本研究以盐肤木mtDNA CO I基因序列作为分子标记,分析有角倍形成的几个盐肤木种群之间的遗传变异、单倍型分布、遗传多样性及其遗传结构等,为深入研究其分子进化及其与角倍蚜之间的协同进化关系提供分子生物学方面的资料,同时可为更好的保护和合理利用这一生物资源提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 材料

盐肤木样本均采自野外自然种群,采集的叶片材料用硅胶干燥保存.样本信息分别见表1(P128).

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与扩增

采用改进的CTAB法[8]提取盐肤木样本基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳检测,测定不同波长下的紫外吸收值(OD值),确定其浓度并估计其纯度.

建立 PCR反应体系,每50μL体系中包含1×Buffer,2.5 mmol·L-1M g2+,0.25 mmol·L-1dN TPs,0.4μmol·L-1每条引物,1.5UTaqDNA聚合酶,2μL(含30～50 ngDNA)模板溶液.反应条件为:94 ℃预变性3 m in,94℃变性30 s,50℃退火40 s,72℃延伸2 min,40个循环后,72℃延伸7 m in.PCR反应在MJ公司PTC-200基因扩增仪上完成,扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度.扩增引物由上海博亚生物技术有限公司合成,序列分别为:

引物 1:5’-TAA TGGGCACA TGCTTTTCAGT-3’,

引物 2:5’-A GTA GTAA TGAAAA GCTGGAGGGCTT-3’.

表1 本研究盐肤木样本采集信息Table 1 Sampling sites of Rhus chinensis M ill

1.2.2 PCR产物的纯化和测序

对于扩增效果良好且足量的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京博迈德公司)进行纯化,纯化后的样品委托北京博迈德生物公司进行双向测序.

1.2.3 数据分析

得到的序列用Sequencher4.8软件进行编辑,剪切掉引物部分,经过核对校正得到的序列用Clustal X 1.83[9]进行排序、比较;应用DnaSP4.0软件[10]统计序列的单倍型,计算平均核苷酸差异、核苷酸多样性和单倍型多样性等;应用Mega4.0[11]计算核苷酸使用频率和碱基组成等.

2 结果与分析

2.1 序列组成及变异

共得到盐肤木9个种群50个个体的m tDNA CO I基因序列,通过校对排序比较分析,结果获得CO I基因序列长1.37 kb,共检测到3个变异位点,全部为单一信息位点,约占分析位点总数的0.22%,分布于840、870和1313位.其中2个变异发生在密码子的第3位点上,占66.7%,1个在第1位点,第2位点无变异位点.其中 T、C、A和 G 4种核苷酸的平均比例分别为34.1%、21.8%、22.5%和21.6%,A+T平均含量为56.6%,G+C含量为43.4%,A+T的含量高于 G+C含量,但是它们之间的差异明显低于昆虫中m tDNA基因核苷酸组成比例,昆虫具有较高的A+T含量[12-14].

2.2 单倍型分布

序列分析结果显示,盐肤木50个m tDNA CO I基因序列共产生3个单倍型:HapA、HapB和 HapC,它们之间只存在位点多态性,HapA与 HapB差异不大,仅在1313位点有1个碱基的替换(G↔A),HapA与HapC在840和869位点各有1个碱基的替换(C↔T),HapB与 HapC差异相对较大,二者之间有3个碱基的替换,分别在840、869(C↔T)以及1313位点(G↔A).HapA存在于所有种群中,可能是祖先单倍型,HapB存在于湖北竹山和四川安县种群的4个个体中,且在竹山种群中出现的几率较高(75%),HapC只有贵州榕江种群的1个个体.独享单倍型的存在,在一定程度上表明盐肤木种群存在着微弱的遗传变异和分化.

2.3 遗传多样性

统计盐肤木种群的单倍型和核苷酸多样性(表2).可见,3种单倍型出现的频率分别是 HapA=0.900、HapB=0.080和 HapC=0.020.种群总核苷酸多样性为0.000 2,单倍型多样性为0.187 0.其中四川种群的核苷酸多样性为0.000 1,单倍型多样性为0.118 0;湖北种群的核苷酸多样性为0.000 3,单倍型多样性为0.385 0;贵州种群的核苷酸多样性为0.000 2,单倍型多样性为0.100 0,说明盐肤木种群CO I基因的遗传变异很低.

表2 盐肤木种群遗传多样性Table 2 Genetic diversity of R.chinensis Mill populations based on CO Isequences

3 讨论

遗传多样性是物种长期进化的产物.物种或种群进化潜力和适应环境的能力取决于遗传多样性的大小;一个种群遗传多样性越高或越丰富,适应环境的能力就越强,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境[15-16].本研究基于m tDNA CO I基因序列对盐肤木种群遗传多样性进行分析,结果显示其单倍型的多样性和核苷酸的多样性均较低.在所测的50条序列中共检测到3个变异位点,出现3个单倍型,单倍型HapA为盐肤木所有种群的共享单倍型,说明它是一种较为稳定的单倍型,很有可能为祖先单倍型.单倍型 HapB为四川安县和湖北竹山种群共享单倍型,单倍型 HapC只存在于贵州榕江种群且只有1个,说明盐肤木种群在m tDNA CO I基因上存在微弱的遗传分化.

CO I基因作为一种有效的分子标记,主要应用在动物,特别是用于昆虫的系统进化研究中.有资料表明,由于m tDNA基因序列的高度保守性和结构上极高的重排率以及低的突变率等,植物m tDNA的进化速率比较缓慢[17].

本研究选择CO I基因作为分子标记,发现该基因的遗传多样性较低,还不足以探明盐肤木种群之间的分化,研究结果也说明CO I基因序列作为植物种群遗传多态性研究的局限性.叶绿体基因组在植物分子系统学研究中使用较为广泛,因为叶绿体比线粒体进化速率更快,对于经历过快速进化的种群具有较高的分辨率[18],而且叶绿体具有同线粒体一样的优点如母系遗传、多拷贝等,将来需结合叶绿体基因对盐肤木种群遗传多样性进行更深入的探讨.加之部分种群标本数量的限制,在一定程度上影响其结果分析的代表性,这可能是导致盐肤木种群CO I基因遗传多样性低的因素之一.

盐肤木为五倍子蚜主要种类—角倍蚜的唯一夏寄主植物,为了研究二者之间的协同进化关系,本研究在五倍子分布区采集标本,试图采用同样的序列分子标记基因CO I进行研究,初步的结果发现植物线粒体DNA基因的变异与蚜虫相应基因的变异相比很小,在进一步的研究中应选择进化速率较快的叶绿体DNA基因序列或其他分子标记方法,同时增加种群和个体数量进行分析,为深入研究其分子进化及其与角倍蚜之间的协同进化关系提供分子生物学方面的资料,同时可为更好的保护和合理利用这一生物资源提供理论基础.

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Genetic Variation of Rhus chinensis Populations Based on mtDNA COI Sequences

AN Miao1,MA En-bo2,REN Zhu-mei1
(1.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China;
2.Research Institute of A p p lied Biology,Shanxi University,Taiyuan030006,China)

Mitochondrial DNA(mtDNA)cytochrome coxidase I(COI)gene was used to exmaine the genetic structure and diversity of aRhus chinensispopulations from China.The sequences(1.37 kb in length)w ere obtained from 50 individuals of the 9R.chinensispopulations.In all the sequences,3 nucleotide site substitutions and 3 hap lotypes(HapA,HapB and HapC)w ere examined,respectively.The base compositions were calculated and the results were:T,34.1%;C,21.8%;A,22.5%and G 21.6%,respectively.The average A+T content was 56.6%w hich was a little higher than G+C content.The low hap lotype diversity(0.187 0)and nucleotide diversity(0.000 2)were detected in this species.Hap A w as shared with about 90.0%of the total individuals,which might be the ancestral hap lotype.HapB was shared with three individuals from Zhushan population and one individual from Anxian population.HapC was examined in one individual of Rongjiang population.The results showed the low genetic diversity and genetic differentiation among theR.chinensispopulations.

Rhus chinensis;m tDNA;CO Igene sequence;genetic diversity

Q349

A

0253-2395(2011)01-0127-04＊

2010-05-10;

2010-08-24

国家自然科学基金(30670361);山西省自然科学基金(2007011078);山西省回国留学人员科研资助项目

安淼(1986-),男,山西太原人,硕士研究生.＊通讯作者:E-mail:zm ren@sxu.edu.cn