海南地区溶藻弧菌遗传多样性的RAPD分析

欧阳吉隆, 周永灿, 吴学贵, 戴小连, 王世锋, 谢珍玉

(海南大学 海南省热带水生生物技术重点实验室, 海南 海口 570228)

海南地区溶藻弧菌遗传多样性的RAPD分析

欧阳吉隆, 周永灿, 吴学贵, 戴小连, 王世锋, 谢珍玉

(海南大学 海南省热带水生生物技术重点实验室, 海南 海口 570228)

以来源于泰国的菌株TG06003作对照, 对采自海南地区的27株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)环境菌株进行了随机扩增多态性DNA标记(RAPD)分析, 其中6株为毒力菌株, 另外22株为非毒力菌株。实验共得到 70个多态性条带, 多态性比率(PPB)为 98.6%。基因多样度的算术平均数和加权平均数分别为0.922和0.454 4, Shannon’s信息指数的算术平均数和加权平均数分别为0.139 1和0.171 3。遗传相似度为0.442 9～0.885 7, 遗传距离为0.121 4～0.752 0。将溶藻弧菌分为毒力菌株和非毒力菌株两个类群进行分析, 结果表明, 毒力菌株的遗传多样性丰富, 它们的基因多样度和Shannon’s信息指数明显高于非毒力菌株; 毒力菌株HN08811、HN08155、HN08809、HN08813明显聚为一类, 另外2株毒力菌株分别与非毒力菌株HN08304和HN08803聚为一类, 溶藻弧菌毒力菌株存在多种遗传型。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus); RAPD; 毒力菌株; 遗传多样性

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae), 弧菌属(Vibrio), 革兰氏阴性短杆菌,是海洋及河口环境中常见细菌种类, 广泛存在于海水养殖环境[1]。该菌是一种条件致病菌, 严重威胁着海南的海水养殖业, 是凡纳滨对虾[2](Penaeus vannameiBoone)、鲑点石斑鱼[3](Epinephelus fario)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)[4]、杂色鲍[5](Haliotis diversicolor)等养殖品种的常见细菌性病原之一。2006年至2008年间, 本实验室人员在海南岛及周边地区的主要海水养殖区采集并分离了28株溶藻弧菌,经人工感染, 确定 6株为毒力菌株, 另外22株为非毒力菌株。作者采用随机扩增多态性 DNA标记(RAPD)技术, 分析毒力菌株与非毒力菌株的遗传多样性, 旨在揭示溶藻弧菌毒力菌株特异遗传型及其特异性分子标记, 为今后开展因溶藻弧菌引发的重大流行病的防治和其致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

共28株溶藻弧菌, 其中27株(表1)采自海南岛,另 1株(TG06003)采自泰国, 分别为 HN08811、HN08155、HN08809、HN08813、HN08335、HN07006、HN08304、TG06003、HN08307、HN08810、HN08806、HN08803、HN08808、HN07011、HN08202、HN08801、HN07014、HN08303、HN08203、HN08805、HN08306、HN07009、HN07005、HN07002、HN08201、HN07010、HN08305、HN08807, 由本实验室分离、鉴定及保种。鉴定方法参照谢珍玉等[6]的方法。Taq酶、dNTPs、MgCl2购自上海申能博彩公司。DNA Maker(DL2000)购自大连宝生物公司。70条RAPD引物(表2)由上海生工合成。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取

将保种的菌株接种于2216E海水营养培养基中,35℃, 180 r/min振荡培养12 h。取1.5 mL菌液4 000 r/min离心1 min, 去上清, 以1 mL无菌水洗涤细菌。细菌基因组DNA提取采用SDS裂解法[7-8], 加入50 μL TE缓冲液, 储存于4℃冰箱备用。

1.2.2 RAPD扩增

RAPD扩增方法主要参考陈偿等[9]的方法并作适当改良。扩增体系为： 0.4 μL Taq 酶(5U/μL)、1 μL dNTPs(10 mmol/L)、2.5 μL buffer (含 MgCl2)、1 μL 引物(100 μmol/L)、1 μL DNA 模板(基因组 DNA 稀释 10倍), 加无菌水补至 25 μL。PCR 反应在 Eppendorf Mastercycle Gradient PCR扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性4 min, 94℃变性1 min, 36℃退火1 min,72℃延伸2 min, 40个循环, 72℃继续延伸10 min, 4℃保存。首先以 HN08811、HN08155、HN08809、HN08307、HN08810 这5株细菌基因组DNA为模板作PCR扩增, 重复3次, 筛选特异性高且重复性好的引物进一步对所有菌株基因组DNA作扩增。

表1 溶藻弧菌分离株的来源情况Tab. 1 The sources of isolated Vibio alginolyticus

表2 70条RAPD引物Tab. 2 70 RAPD primers

1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物, 在凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ, Biorad)上观察记录实验结果。

1.2.3 数据处理

电泳图中相同迁移位置上有条带的记1、无条带的记0, 以1、0数列矩阵形式记录PCR产物的扩增位点。利用 popgene 32软件对数据进行分析, 得出Nei’s基因多样度、Shannon’s信息指数、遗传相似度、遗传距离等数据, 并根椐遗传距离利用Mega 4构建UPGMA系统进化树[10-12]。

2 实验结果

2.1 RAPD引物筛选和扩增产物多态性

从70条引物中筛选并获得8条特异性高且重复性好的引物, 具体见表3。引物S2103、S2084和S330的电泳指纹图谱分别见图1、图2和图3。

8条随机引物共产生了 71条带, 其中多态性条带70条, 多态性比率为(PPB)为98.6%。平均每条引物产生了7.8条多态性条带, 产物大小在100～2 000 bp之间。Nei’s基因多样度的算术平均数为0.922, 加权平均数为0.454 4。Shannon’s信息指数的算术平均数为0.139 1, 加权平均数为0.171 3。遗传相似度为0.442 9～0.885 7, 遗传距离为 0.121 4～0.752 0。以引物 S330扩增时, 毒力菌株 HN08811、HN08155、HN08809和 HN08813基因组产生了分子质量约为1 200 bp的特异性条带。

2.2 毒力菌株和非毒力菌株的遗传多样性分析

毒力菌株和非毒力菌株的遗传统计数据详见表4。将毒力菌株和非毒力菌株分为两个类群进行数据分析, 毒力菌株产生了 54个多态性位点, 非毒力菌株产生了 59个多态性位点。毒力菌株的 Nei’s基因多样度的算术平均数与加权平均数以及Shannon’s信息指数的算术平均数与加权平均数分别为 0.301 6、0444 1、0.184 5和0.259 7, 非毒力菌株对应的数据分别为0.255 6、0.397 4、0.162 5和0.224 6。毒力菌株的两种Nei’s基因多样度和两种Shannon’s信息指数均高于非毒力菌株。毒力菌株之间的遗传相似度为 0.514 3～0.757 1, 遗传距离为 0.278 2～0.665 0, 非毒力菌株之间的遗传相似度为 0.471 4～0.885 7, 遗传距离为0.121 4～0.752 0。

表3 筛选引物名称与扩增结果Tab. 3 The coding of primers and the amplification results

图1 引物S2103对28株溶藻弧菌的PCR扩增结果Fig. 1 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S2103

图2 引物S2084对28株溶藻弧菌的PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S2084

图3 引物S330对28株溶藻弧菌的PCR扩增结果Fig. 3 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S330

表4 溶藻弧菌毒力菌株和非毒力菌株的遗传统计数据Tab. 4 Genetic statistics of virulent strains and non-virulent strains of Vibrio alginolyticus

利用UPGMA法对28株溶藻弧菌进行聚类分析(图 4), 其中 4株毒力菌株(HN08811、HN08155、HN08809、HN08813)的亲缘关系很近, 明显聚为一类。图 3中黑色箭头所指的条带是该类菌株的特异多态性条带; 毒力菌株 HN08335与非毒力菌株HN08803聚为一类, 它们的遗传相似度和遗传距离分别为0.814 3和0.205 4; 毒力菌株HN07006与非毒力菌株 HN08304聚为一类, 它们的遗传相似度和遗传距离也分别为 0.814 3和 0.205 4。毒力菌株HN08335和HN07006与另外4株毒力菌株的遗传相似度和遗传距离详见表5。

3 讨论

Warmer等[13]认为包括溶藻弧菌在内的多种弧菌具有很强的遗传多样性; Ripabelli[14]和 George[15]的实验都证明相同生物来源的溶藻弧菌菌株具有明显差异; 陈偿等[8]发现, 海南省三亚与陵水地区的高密度对虾养殖场中, 溶藻弧菌的基因型也表现为较高的多样性。本实验结果表明, 溶藻弧菌变异性强, 6株毒力菌株之间的遗传距离变幅为0.242 8, 22株毒力菌株之间的遗传距离变幅为 0.630 6, 菌株遗传多样性丰富, 这与前人的研究结果基本一致; 而且, 毒力菌株的Nei’s基因多样度和Shannon’s信息指数都明显高于非毒力菌株, 这很可能是由于毒力菌株比非毒力菌株变异性更高所致。前人的研究表明, 溶藻弧菌的毒力基因主要存在于基因组中, 而与质粒无关[16-17]。因此, 作者推测溶藻弧菌的毒力相关功能基因可能是导致毒力菌株与非毒力菌株之间产生明显遗传差异主要原因之一, 这些毒力相关功能基因应该存于染色体基因组中, 而且, 溶藻弧菌毒力基因系统并非简单的由一个或者几个基因构成, 更可能是由许多相关基因[18-20]组成, 这些基因直接影响整个基因组遗传多样性。

本实验结果还表明, 在遗传距离为 0.21处, 所有菌株可分为4个组, 其中第1组含有2株毒力菌株(HN08335和HN07006)和20株非毒力菌株; 第2组只含有1株细菌, 即TG06003, 表明来源于泰国的菌株与海南地区的菌株遗传差异较大, 属于不同的地理种群; 第3组也只含有1株细菌, 为HN08303, 这

图4 溶藻弧菌的UPGMA亲缘关系聚类图Fig. 4 The UPGMA dendrogram of vibrio alginolyticus

表5 溶藻弧菌毒力菌株之间的遗传多样度和遗传距离Tab. 5 Genetic diversity and genetic distances among virulent strains of Vibrio alginolyticus

一菌株也与其他菌株差异较大; 第 4组则只含有 4 株毒力菌株, 即 HN08811、HN08155、HN08809、HN08813, 表明这4株细菌与其他24株的遗传差异较大, 为一个相对独立的遗传型。本实验室采用抑制性差减杂交技术, 以非毒力菌株 HN08801为驱动子(Driver), 构建了毒力菌株HN08155差减基因组文库,从中获得了80个可能与毒力相关基因片段, 并以上述 80个毒力相关基因对这 28个菌株作了基因型分析, 结果也表明, HN08155、HN08809、HN08811、HN08813这4株毒力菌株的亲缘关系更近(结果正在整理中)。因此, 尽管溶藻弧菌不同菌株之间的变异性可能很高, 但还是存在同一遗传型毒力菌株的可能。同时, 本实验确定了 HN08155、HN08809、HN08811、HN08813这 4株毒力菌株的特异性条带(图 3), 该条带可以作为鉴定这类遗传型毒力菌株的分子标记, 可用于因这类遗传型溶藻弧菌引发的重大流行病的快速诊断。

[1]陶保华, 胡超群, 任春华. 海水鱼类病原弧菌对对虾的致病力及其疫苗的免疫预防作用[J]. 热带海洋学报, 2001, 20(4 )： 68-73.

[2]温崇庆, 薛明, 何红, 等. 两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定[J]. 微生物学通报, 2008, 35(3)：346-352.

[3]黄志坚, 何建国. 鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定的致病性[J]. 中山大学学报, 2002, 41(5)： 64-67.

[4]陈晓燕, 胡超群, 陈偿, 等. 人工养殖点带石斑鱼弧菌病病原菌的分离及鉴定[J]. 海洋学报, 2003, 27(6)：68-72.

[5]周晶, 蔡俊鹏, 杨洪志. 南方杂色鲍大规模死亡病原菌的分原鉴定及其回归感染实验[J]. 海洋湖沼通报,2006, 03： 54-59.

[6]Xie Z Y,Hu C Q, Chen C, et al. Investigation of sevenVibriovirulence genes amongVibrio alginolyticusandVibrio parahaemolyticusstrains from the coastal mariculture systems in Guangdong, China[J]. Letters in Applied Microbiology, 2005, 41(2)： 202-207.

[7]李钧敏. 土壤可培养细菌 DNA的提取及 RAPD 条件的优化[J]. 微生物学通报, 2003, 30(5)： 5-9.

[8]Picard C, Ponsonnet C, Paget E, et al. Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1992,58(9)：2717-2722.

[9]陈偿, 胡超群, 张吕平, 等. 用 RAPD 技术对养殖环境溶藻弧菌遗传多样性的研究[J]. 热带海洋学报,2002, 21(4)： 49-54.

[10]江香梅, 温强, 叶金山, 等. 闽楠天然种群遗传多样性的 RAPD分析[J]. 生态学报, 2009, 29(1)： 438-444.

[11]谢珍玉, 郑成木, 单加林. 海南部分野生菊科植物类缘关系的RAPD分析[J]. 海南大学学报(自然科学版),2006, 24(3)： 317-321.

[12]Høi L, Dalsgaard A, Larsen J L, et al. Comparison of Ribotyping and randomly amplified polymorphic DNA PCR for characterization ofVibrio vulnificus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(5)：1674-1678.

[13]Warmer J M, Oliver J D. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of clinical and environmental isolates ofVibrio vulnificusand other vibrio species[J].Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(3)：1141-1144.

[14]Ripabelli G, Sammarco M L, McLauchlin J, et al. Molecular characterisation and antimicrobial resistance ofVibrio vulnificusandVibrio alginolyticusisolated from mussels (Mytilus galloprovincialis) [J]. Systematic and Applied Microbiology, 2003, 26(1)： 119-126.

[15]George M R, John K R, Iyappan T, et al. Genetic heterogeneity amongVibrio alginolyticusisolated from shrimp farms by PCR fingerprinting[J]. Letters in Applied Microbiology, 2005, 40(2)： 369-372.

[16]谢珍玉, 胡超群. 弧菌毒力基因水平转移与进化的进展[J]. 海热海洋学报, 2005, 24(3)： 86-95.

[17]Zorrilla I, Moriñigo MA, Castro D, et al, 2003. Intraspecific characterization ofVibrio alginolyticusisolates recovered from cultured fish in Spain [J]. Journal of Applied Microbiology, 2003, 95(5)： 1106-1116.

[18]钱荣华, 于涟, 毛芝娟, 等. 溶藻弧菌铁调蛋白基因的克隆表达及其特征分析[J]. 科技通报, 2007, 23(5)：651-657.

[19]蔡双虎, 鲁义善, 吴灶和, 等. 溶藻弧菌 asp基因在大肠杆菌中表达活性研究及条件优化[J]. 广东海洋大学学报, 2008, 28(3)： 45-49.

[20]Cai S H, Wu Z H, Jian J C, et al. Cloning and expression of the gene encoding an extracellular alkaline serine protease fromVibrio alginolyticusstrain HY9901,the causative agent of vibriosis inLutjanus erythopterus(Bloch) [J]. Journal of Fish Diseases, 2007, 30(8)：493-500.

RAPD analysis of genetic diversity ofVibrio alginolyticusisolated from Hainan province

OU YANG Ji-long, ZHOU Yong-can, WU Xue-Gui, DAI Xiao-lian, WANG Shi-feng,XIE Zhen-yu
(Hainan University, Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228, China)

Sep., 12, 2010

Vibrio alginolyticus; RAPD, virulent strains; genetic diversity

Taking the Thai strain TG06003 as a control, 27 strains ofVibrio alginolyticuscollected from Hainan maricultural environment were analyzed using the random amplified polymorphic DNA marker (RAPD) method.Six strains were virulent and the other 22 strains were non-virulent. Seventy polymorphic bands were produced by PCR with eight selected primers, and the PPB was 98.6%. The arithmetic average and the weighted average of gene diversity were 0.922 and 0.454 4, respectively, and the arithmetic average and the weighted average of Shannon’s information index were 0.1391 and 0.171 3, respectively. Distribution of genetic similarity was between 0.442 9 ～0.885 7, and genetic distances were distributed between the 0.121 4～0.752 0. Virulent strains HN08811, HN08155,HN08809, and HN08813 were clearly clustered together. However, the other two virulent strains were clustered with non-virulent strains. The gene diversity of virulent strains was high, and their genetic diversity and Shannon’s information index were significantly higher than those of non-virulent strains. Our results indicate that virulent strains and non-virulent strains ofVibrio alginolyticushave multiple genetic types.

S941.42

A

1000-3096(2011)07-0030-07

2010-09-12;

2011-03-21

国家科技支撑计划项目(2009BAB44B02); 国家自然科学基金项目(30760190, 31060360); 霍英东教育基金会高等院校青年教师基金基础性研究课题(121030); 农业科技成果转化项目(2009GB2E200302)

欧阳吉隆(1986-), 男, 江西吉安人, 硕士研究生, 研究方向：水生生物病害与控制, 电话： 15248929458, ouyangjilong23@yahoo.com.cn;谢珍玉, 通信作者, 博士后, 副教授, xiezyscuta@163.com

梁德海)