RP-HPLC法测定超临界提取物中淫羊藿苷的含量

关雅琼，张曜武，张龙，牛晓丽

（青岛科技大学工学院药学系，山东青岛266042）

RP-HPLC法测定超临界提取物中淫羊藿苷的含量

关雅琼，张曜武，张龙，牛晓丽

（青岛科技大学工学院药学系，山东青岛266042）

目的：建立淫羊藿叶超临界提取物中淫羊藿苷的含量测定方法。方法：采用RP-HPLC法，Hypersil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-0.1%冰醋酸水溶液梯度洗脱，流速1 mL·min-1，检测波长270 nm。结果：淫羊藿苷在0.212～2.12 μg进样量范围内线性关系良好，平均加样回收率98.7%，RSD为1.18%（n=6）。结论：该法简便、易操作，适用于淫羊藿超临界提取物中淫羊藿苷的含量测定，可有效地控制淫羊藿超临界提取物的质量。

淫羊藿；淫羊藿苷；超临界提取物；高效液相；含量测定

本实验旨在对淫羊藿CO2超临界流体萃取物的研究中，建立准确，快速，灵敏的质量控制方法，以期更有效的开发利用这一天然药物资源。

1 仪器与试药

1.1 仪器

doiNEX高效液相色谱仪（配有PDA-3000光电二极管矩阵检测器，P-3400A分析泵），Chromeleon色谱工作站；HA221-50-06型超临界萃取装置（江苏南通华安公司）；FA1004N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限有限公司）；KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品自中国药品生物制品检定所购买；淫羊藿叶购自河南聚仁中药饮片有限公司，批号20091115；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯；二氧化碳（99.95%）。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿超临界提取物的薄层色谱鉴别

2.1.1供试品溶液的制备

取淫羊藿药材粉末100 g装于萃取釜，以CO2为溶剂，设定萃取釜、解析釜的温度分别为60℃、25℃，压力分别为30 MPa、6 MPa，进行动态萃取2 h，得到萃取物，制得供试品溶液备用。

2.1.2 淫羊藿苷对照品溶液Ⅰ的制备

精密称取淫羊藿苷对照品10.0 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1.0 mg·mL-1的对照品溶液Ⅰ。

2.1.3 薄层鉴别

分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液I，硅胶H板上点样，以氯仿-甲醇-甲酸为展开剂，1%三氯化铝乙醇溶液显色，置紫外灯365 nm下检视，供试品溶液在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，说明样品中含有淫羊藿苷成分。

2.2 淫羊藿超临界提取物的高效液相色谱检测

2.2.1 色谱条件

本文参照有关文献[5]，制定如下色谱条件，色谱柱:Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：流动相A（甲醇）和B（0.1%冰醋酸溶液）梯度洗脱0min，A30%，B70%；10min，A55%，B 45%；15 min，A 67%，B 33%；20 min，A 68%，B 32%；22 min，A 75%，B 25%。流速：1 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL，色谱图见图1。

2.2.2 色谱系统适用性实验

按淫羊藿苷峰计算，色谱系统的理论塔板数为48 784;淫羊藿苷与其相邻的色谱峰的分离度大于1.5，淫羊藿苷与相邻的色谱峰可以完全分离。

2.2.3 淫羊藿苷对照品储备液Ⅱ的制备

精密称取淫羊藿苷对照品10.6mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为1.06 mg·mL-1的对照品储备液Ⅱ。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液Ⅱ0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。按色谱条件测定，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程:Y=48.838X+ 3.467 8，r=0.999 1。结果:淫羊藿苷在0.212～2.12 μg进样量范围内线性关系良好。

2.2.5 样品稳定性实验

样品溶液室温放置，于8 h内每间隔2 h测定淫羊藿苷的含量，RSD为0.99%，说明样品溶液在8 h内基本稳定。

2.2.6 精密度实验

按色谱条件测定，对0.010 6、0.063 6、0.106 mg·mL-13个质量浓度分别进样3针，量取峰面积，计算RSD。高、中、低3个质量浓度的RSD分别为1.17%、1.92%、1.59%。由实验结果可知，测定方法的RSD值不大于1.92%。

2.2.7 重复性实验

取同一批淫羊藿药材,按“2.1.1”项下方法，平行制备6份供试品溶液,分别测定含量。淫羊藿苷含量测定结果的RSD为2.22%，表明分析方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率实验

精密称取同一批号已知含量的样品6份，分别按其中淫羊藿苷含量的80%、100%、120%加入淫羊藿苷对照品，按样品溶液的制备方法操作，分别进样，计算回收率。平均加样回收率为98.7%，RSD为1.18%（n=6）。

2.3 淫羊藿超临界萃取物的测定

分别按上述确定的方法制备样品后测定淫羊藿苷的含量，3次测定结果得到淫羊藿苷在药材中的平均含量为0.092 mg/g。

3 结论

3.1 比较图b和图c可以看出，超临界流体萃取的选择性较好，萃取物的淫羊藿苷含量较高，杂质成分相对较少，有利于粗提物的进一步精制。索氏提取样品的杂质相对较多，而且需要耗费更多的有机溶剂和提取时间。超临界萃取技术可以应用于淫羊藿中淫羊藿苷的提取。

3.2 实验先后选择甲醇-0.5%冰醋酸（60∶40）、甲醇-0.1%冰醋酸（60∶40），甲醇-0.1%冰醋酸(梯度洗脱)体系，从分离情况和出峰时间等综合分析，选择了甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脱，色谱条件稳定。

3.3 超临界CO2萃取技术在中药提取中具有绿色环保等诸多优点，本实验针对该技术提取的淫羊藿超临界CO2萃取物，建立了高效液相色谱分析方法，具有较高的精密度，适用于检测淫羊藿超临界提取物中淫羊藿苷的含量，同时也为黄酮类成分的超临界萃取物质量控制提供参考。

［1］侯家玉.中药药理学[M].北京:中国中医药出版社,2002:235-237.

［2］李娌,王学美.淫羊藿苷药理作用研究进展[J].中国中药杂志, 2008,33(23):2728-2731.

［3］张华峰,杨晓华.淫羊藿药材质量控制的问题与对策[J].中草药, 2009,40(1):160-162.

［4］赵东胜,刘桂敏,吴兆亮.超临界流体萃取技术研究与应用进展[J].天津化工,2007,21(3):10-12.

［5］赵焕君,胡天蓉,张君.HPLC法测定参茸强肾胶囊中淫羊藿苷的含量[J].辽宁中医杂志,2008,(7).

Determination of icariin in supercritical fluid extracts of epimedium by RP-HPLC

GUAN Ya-qiong,ZHANG Yao-wu,ZHANG Long,NIU Xiao-li
(Department of Pharmacy,College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology, Qingdao Shandong 266042,China)

Objective:To determine the content of icariin in supercritical fluid extracts of Epimedium by RPHPLC.Methods:The sample was separated on a C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)with the mobile phase of methanol-0.1%acetic acid in water solution as gradient eluent.The flow rate was 1 mL·min-1and the detection wavelength was set at 270 nm.Results:The calibration curve was linear in the range of 0.212～2.12 μg for icariin;The average recovery was 98.7%，RSD=1.18%（n=6).Conclusion:The method is rapid and accurate.It can be used as a method of quality control for supercritical fluid extracts of epimedium.

epimedium;icariin;supercritical fluid extracts;HPLC;content determination

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.03.019

R284

A

1008-1267（2011）03-0055-03

2010-11-24

关雅琼（1985-），女，硕士研究生，研究方向：中药制剂现代化。