ELISA法检测玉米中AFB1样品提取方法改进的研究

张海涛，陆廷瑾，蒋 飞，杨婷婷，龚 燕，蔡正森

（江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏 无锡 214063）

ELISA法检测玉米中AFB1样品提取方法改进的研究

张海涛，陆廷瑾，蒋 飞，杨婷婷，龚 燕，蔡正森*

（江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏 无锡 214063）

在用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定玉米AFB1含量的过程中，通过改进样品提取方法，将样品本身的影响因素所造成的误差降至最小.结果表明：ELISA定量检测的标准工作溶液与样品提取液内成分相当时，样品检测结果准确，回收率稳定在83%以上.

酶联免疫吸附测定法；玉米；黄曲霉毒素B1；提取方法

0 前言

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）具有极强的致癌性和致突变性.动物采食了被AFB1污染的玉米后，可引起急性病变死亡，还可以在体内蓄积或者经新陈代谢转化成其他有毒物质在体内分布[1].人若食用AFB1中毒的组织，健康将受到极大的损害，因此，玉米中黄曲霉毒素的检测日益受到重视.由于玉米中含有大量可溶性淀粉及植物蛋白，往往导致待测样品中AFB1提取不完全.为此，作者对ELISA法检测玉米中AFB1的提取方法进行了研究，以期将样品本身的影响因素所造成的误差降至最小.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

MK3酶标仪：芬兰雷勃公司；小型粉碎机、MS2型微量振荡器：德国IKA公司；微量移液器：芬兰雷勃公司；SPX—250B生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：江苏省苏微微生物研究有限公司；AFB1标准品：美国sigma公司；甲醇：分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司；超纯水（实验室自制）；FAPAS动物饲料样品；4份玉米样品：市售.

1.2 方法

1.2.1 样品提取

按照GB/T17480-2008规定的提取方法，称取5 g试样，精确至0.01 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入50%甲醇-水溶液25mL，加塞振摇10min，过滤，弃去1/4初滤液后收集适量滤液作为待测试样[2].按此方法另增加60%甲醇-水、70%甲醇-水、80%甲醇-水提取样品作为试样.

1.2.2 样品及加标回收率的测定与计算

在4份玉米样品中加入AFB1标准工作溶液，加标浓度为10μg/L.采用1.2.1方法对样品进行提取，制备ELISA法分析试样，进行样品加标回收率的计算.

1.2.3 标样溶解相的改进

标样溶解相的改进是指用阴性样品的提取液配制标准工作溶液，使标样与待测样品液中组分大致相同.

（1）标准工作溶液配制：用10%甲醇-水溶液提取不含AFB1的组分相同的样品，用所得滤液上清液配制试剂盒中6个系列的标准工作溶液，使样品中的影响因素同时存在于标准工作溶液和待测样品液中，统一标样与待测样液的组分，以减少或消除样品组分的影响.

（2）样品提取：分别用50%甲醇-水、70%甲醇-水按照GB/T 17480-2008规定的提取方法提取4份玉米样品，制备待测样品液.

（3）试样加标回收：在4份玉米样品中加入10μg/L的AFB1标准工作溶液，进行加标回收率的考察.

1.2.4 试样测定

（1）酶联免疫吸附法检测：从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温；准备好所用试剂，对准备好的待测样品液按照试剂盒说明书进行操作.

（2）高效液相色谱法（HPLC）确证：将4份市售玉米样品提取液过多功能净化柱净化，衍生后以甲醇水溶液为流动相，紫外检测器检测.

1.2.5 试验有效性确证

所有ELISA分析过程中带入国际标准样FAPAS，以确证试验数据的有效性.FAPAS样品属性见表1.

表1 FAPAS样品属性

2 结果与分析

2.1 不同体积分数甲醇提取液测定值比较（表2）

由表2可知，当提高甲醇-水提取液中甲醇比例时，样品的检出值与甲醇体积分数呈正相关；在试验中采用同样的提取方法，带入质控样品FAPAS对试验的有效性进行确证，结果发现FAPAS的结果与试样呈现同样的趋势，即样品值与提取液中甲醇体积分数呈正相关，结果见表3.参照给定的FAPAS样品属性（见表1），当甲醇体积分数足够大时，FAPAS值超出给定的有效区间，出现假阳性现象.由此我们可以断定当甲醇体积分数增高时试样本底会逐步升高甚至会出现假阳性现象，给ELISA法定量检测工作带来困扰.因此，单纯改变样品提取液中甲醇的体积分数，并不能有效消除或降低ELISA检测过程中样品内在相关组分的影响.

表2 不同体积分数甲醇水提取液检测结果 μg/kg

表3 不同体积分数甲醇水提取液测定FAPAS结果 μg/kg

2.2 统一标准工作溶液组分方法与HPLC法比较

表4所显示的结果是用1.2.3中的方法所配制的标准工作溶液进行酶联免疫分析所得结果，并与HPLC法检测结果进行比较（见表5）.

通过比较表4与表5，可以看出，改进标准工作溶液方法后，ELISA检测结果与HPLC基本一致，且回收率至少在83%以上.

表4 标样溶解相改进后检测结果 μg/kg

表5 HPLC法样品检测数据 μg/kg

3 结论

由于玉米本身中含淀粉和植物蛋白等因素的影响，造成在提取过程中不能完全将AFB1从待测样品中分离出来，从而导致检测结果不准确，甚至可能因为提取液中甲醇体积分数过高而使检测结果出现假阳性现象.采用标样溶解相的改进方法，能充分解决玉米中自身影响因素所产生的干扰，得出较准确的样品检测结果，并且提高了样品的加标回收率.

［1］居乃琥.黄曲霉毒素［M］.北京:轻工业出版社，1980:5-98.

［2］GB/T 17480-2008，饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法［S］.

IMPROVEMENTSON EXTRACTION OF AFB1IN MAIZE BY ELISA

ZHANG Hai-tao， LU Ting-jin， JIANG Fei， YANG Ting-ting， GONG Yan， CAIZheng-sen
（Jiangsu SuweiMicrobiology Research Co.， Ltd.， Wuxi214063， China）

The paper aimed to improve the extraction method of AFB1in maize by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)so as to m inim ize the error caused by the affecting factors of the samples.The results showed that the sample detection result was accurate,and the recovery rate was above 83%when the standard work solution for ELISA quantitative detection was equivalent to the components of a sample extraction solution.

ELISA； maize； AFB1； extractionmethod

TS210

B

CNKI:41-1378/N.20111028.0857.014

1673-2383（2011）05-0058-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20111028.0857.014.html

网络出版时间：2011-10-28 08:57:53 AM

2011-03-11

张海涛（1986-），男，江苏泗阳人，助理工程师，主要从事食品饲料水质安全生物监控技术研究.

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