免疫层析试纸法快速检测粮食中黄曲霉毒素B1的验证研究

刘 坚，熊 宁，刘 利，余敦年

（湖北国家粮食质量监测中心，湖北 武汉 430061）

免疫层析试纸法快速检测粮食中黄曲霉毒素B1的验证研究

刘 坚，熊 宁，刘 利，余敦年

（湖北国家粮食质量监测中心，湖北 武汉 430061）

4个国家粮食质量监测机构，会同两家免疫层析试纸开发厂商，使用稻谷、玉米两种受黄曲霉毒素B1污染的原始样本，用高效液相色谱法和免疫层析试纸法对粮食中黄曲霉毒素B1测定方法进行了对照研究，对免疫层析试纸法进行了可行性验证.结果表明：免疫层析试纸法和高效液相色谱法的相符率可达90.5%以上；免疫层析试纸法操作简单，检测准确、方便、快速，可用于现场快速检测和初筛粮食中的黄曲霉毒素B1.

黄曲霉毒素B1；免疫层析；胶体金；高效液相色谱法

0 前言

黄曲霉毒素B1（AfLatoxin B1，AFB1）是目前已知致癌性和毒性极强的真菌毒素之一，1993年被世界卫生组织癌症研究机构确定为人类“I类”致癌物[1].粮食在生产、收获、储存和流通过程中，均可能受到黄曲霉毒素B1的污染，特别是在高温高湿的粮食产区，若受灾害性天气影响，这一问题会更加突出.我国对粮食中AFB1设定了严格的限量标准，但处在粮食流通前沿的收购环节长期以来存在检不了、检不快的问题.

目前国家标准规定的黄曲霉毒素B1的检测手段主要有薄层法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法（HPLC法）[2]和酶联免疫吸附法（ELISA法）[3].这些方法均对试验条件和检测技术有较高的要求，检测时间长，检测步骤繁琐或成本太高，不能满足现场快速检测的需要.研制简便、快速、经济可行的黄曲霉毒素B1的检测方法，对于从源头上控制粮食黄曲霉毒素污染十分重要.

免疫检测技术是以抗体或抗原作为分析的基础物，对待测物进行定量或定性分析的检测方法[4]，自Beggs等[5]设计检测人绒毛促性腺激素（HCG）的免疫胶体金层析系统以来，免疫检测技术正朝着定量、多组分分析[6]、高灵敏度、高特异性（即更加准确）、方便快速以及更加经济适用的方向发展，该技术在国内外已广泛应用于医学检测[7]、食品质量监测[8]、环境监测[9-10]、农业和畜牧业检测[11-12]、出入境检验检疫[13]等多个领域，因而该方法在粮食中的运用具备一定的基础.

为了研究和验证粮食中黄曲霉毒素快速检测方法的可行性，国家粮食局标准质量中心组织湖北国家粮食质量监测中心、北京国家粮食质量监测中心、重庆国家粮食质量监测中心和广西国家粮食质量监测中心会同德国拜发和上海快灵2家免疫层析试纸开发商共同进行了近500次的验证试验，为免疫层析试纸方法在粮食检验中的推广应用提供了重要的技术参考.

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.2 技术步骤

首先用酶联法筛选得到不同黄曲霉毒素B1含量的稻谷（糙米）、玉米原始验证样品，再由4家国家粮食质量监测中心按照GB/T 18979—2003规定的免疫亲和层析净化高效液相色谱法对验证样品进行测试,确定AFB1含量值，同时使用黄曲霉毒素质控标准样品，确保定值的准确性.然后用测试卡进行快速检验，对于卫生限量临界值的样品，遵循只可以出现假阳性，不能够出现假阴性的原则，达到快速初筛效果.

1.3 测试卡及其方法原理

验证试验使用德国拜发公司的测试条和上海快灵公司的测试卡，两者方法原理有所不同.德国拜发公司生产的免疫层析检测条，采用非竞争结合的双抗体夹心法；上海快灵公司生产的胶体金检测试纸卡，采用竞争结合的胶体金法.这两种测试卡都是基于特异性抗原抗体反应和免疫层析技术，但是，双抗体夹心法利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.测试时，样品中黄曲霉毒素B1与固相载体上的抗体结合后再与检测带上的酶标抗体结合而显色，表明为阳性样品；反之，检测色带不显色，结果为阴性.而胶体金法通过特异标记抗体竞争结合固定在硝酸纤膜上的AFB1—BSA（BSA,牛血清白蛋白）完全抗原和样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）.测试时，样品中的黄曲霉毒素B1在渗移过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜上AFB1-BSA完全抗原的结合，使测试区的检测色带不显颜色，结果为阳性；反之，检测色带显红色，结果为阴性.

1.4 样品的前处理

1.4.1 免疫层析检测条的样品前处理

准确称取粉碎后（细度为全部通过20目筛）的试样10.0 g，置于50mL带盖离心管中，加入20.0mL的70%甲醇，充分振荡3～5min，静置3min，过滤或4 000 r/min离心1 min，待分层，取上清液 50μL，加层析试液（流动相、厂家提供）100μL混匀为待测试液.

1.4.2 胶体金检测试纸卡的样品前处理

准确称取粉碎后（细度为全部通过20目筛）的试样2.0 g，置于15 mL带盖离心管中，加入2.0 mL的去离子水和8.0mL乙酸乙酯，振荡5min，取2.0 mL上层清液至小玻璃烧杯中，用电吹风吹干，冷却到室温后，根据不同的谷物类残留限量的卫生标准，按表1加稀释液溶解残留物得待测试液.

表1 不同黄曲霉毒素B1稀释倍数

1.4.3 不同浓度验证样品的制备

通过称量不同质量的阳性样品和阴性样品，然后采用混匀的方法来配置不同浓度梯度的阳性样品.参加验证单位对高浓度的样品用高效液相方法进行定值试验（见表2），再称取不同质量的阴性和阳性样品混匀，得到不同浓度样品，用高效液相方法进行测定，测定结果基本与理论计算结果一致（见表3）.表明制备的验证样品可以使用.

1.5 点样层析

将测试条（卡）平放在桌面上，取待测液滴加于检测条（卡）的操作区，同时计时，在规定时间内读取结果.

对于免疫层析检测条，将100μL待测溶液加入检测条的操作区，在4 min、8 min或16 min后读取结果；胶体金检测试纸卡是将3～4滴待测溶液加入检测条的操作区后5 min判读结果.

教学效果：通过具体的任务驱动，项目教学，学生亲自动手操作，参与了整个学习过程，看到了效果，感到很好玩，提升了学生的成就感。每完成一个任务，都对完成情况进行总结，对于表现好的小组，进行表扬，对于效果不理想的小组，及时分析原因。每个学生都参与到整个教学过程，增强了学生学习本门课程的兴趣，培养了学生的职业素养。

1.6 结果判定

以现行粮食卫生标准[14]规定的限量为基础判断检测结果；即糙米（稻谷）中黄曲霉毒素B1含量＜10μg/kg为阴性，含量≥10μg/kg为阳性；玉米中黄曲霉毒素B1含量＜20μg/kg为阴性，≥20μg/kg为阳性.

1.6.1 免疫层析检测条的结果判定

分别在4 min、8 min、16 min对检测条观察.若样品中黄曲霉毒素B1含量≥20μg/kg，则检测色带约在4 min显色；含量≥10μg/kg则检测色带约8 min显色，含量4μg/kg时则检测色带约16 min后显色，参见表4.

表2 样品的定值试验结果

表3 不同浓度样品的配置试验

表4 不同时间检测条对应的检测结果

1.6.2 胶体金检测试纸卡的结果判定

依据试纸卡的显色结果，可判断为阳性、阴性和无效3种结果，见图1.

图1 测试卡的显色图

1.7 试验条件和时间

两种检测卡对实验条件不作特定要求，整个检测过程均可在15～25min完成.

2 结果与分析

2.1 样品中AFB1快速测定结果

制备了不同浓度梯度的糙米和玉米样品.糙米中黄曲霉毒素 B1浓度含量梯度：<5μg/kg，5～10μg/kg，10～15μg/kg，>15μg/kg；玉米中黄曲霉毒素 B1浓度含量梯度：<10μg/kg，10～20μg/kg，>20μg/kg.湖北、北京和重庆3家质检机构分别对制备好的样品进行测定，结果见表5.

从表5可知，3家质检机构分别用拜发和快灵试纸条共测定糙米样品21份和玉米粉碎样品21份.检测结果结合测试卡的检测误差范围，糙米样品的判定结果准确率，快灵达到90.5%，拜发达到100%；玉米样品的判定结果准确率，快灵达到90.5%，拜发达到100%.

2.2 测试卡稳定性验证

进行了同批次、不同批次测试卡的稳定性验证试验，结果见表1—表8.

拜发和快灵测试卡分别对9份玉米样品和9份糙米样品进行测定（见表6），糙米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间 8.0～17.6μg/kg，玉米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间6.2～30.3μg/kg.每份样品进行10次测定，快灵和拜发试纸条分别对糙米共检测90次，准确性分别达到95.6%和97.8%，快灵和拜发试纸条分别对玉米共检测90次，准确性分别达到94.4%和97.8%.

3个不同批次的两种测试卡分别对7份玉米和5份糙米样品测定，玉米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间 0.87～29.6μg/kg，糙米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间1.0～19.8μg/kg.双测定的结果完全相一致，同时3个批次间的判定结果也完全一致，重现性达到100%（见表7和表8）.

2.3 误差试验

两种测试卡针对糙米样品和玉米样品的检测误差范围分别是±2μg/kg和±4μg/kg，即黄曲霉毒素B1含量在8～10μg/kg的阴性糙米样品，允许判为阳性；黄曲霉毒素B1含量在16～20μg/kg的阴性玉米样品，允许判为阳性.而超过国家限量标准范围只能判阳性，不能判阴性.如表9的判定结果准确性是90%.

表5 不同机构用两种检测卡对糙米和玉米样品的测定结果 μg·kg-1

2.4 最低检出限试验

依据测试卡的最低检出限，制备相对应浓度的标准品溶液用测试卡进行快速测定.测定结果见表10和表11，快灵测试卡的最低检出限为5μg/kg，拜发测试卡的最低检出限为4μg/kg.

2.5 整颗粒粮食的检测结果

试验中使用整颗粒样品进行了可行性试验，结果见表12.整颗粒糙米样品的检测准确率是60%，整颗粒玉米样品的检测准确率低于50%.因此，使用整粒粮食样品直接检测的方式不可取，其假阴性率较高.结合表5的测试结果可以看出，在试样混匀的条件下，粉碎细度达到全部过20目筛可以满足检测要求（注：快灵测试卡可以对整颗粒样品进行测试，拜发测试卡不适用于整颗粒样品的测试）.

表6 不同监测机构对同批次测试卡稳定性试验数据

表7 不同批次快灵测试卡稳定性试验数据

表8 不同批次拜发测试卡稳定性试验数据

表9 方法的误差试验结果

表10 快灵测试卡的测定结果

3 结论

（1）通过以上验证试验可知，两种快速测试卡（条）的检测结果与高效液相色谱法的一致性达到90.5%以上；同批次的快速测试卡（条）的检测结果重复性一致性较好；3个不同批次的快速测试卡（条）的检测结果重现性达到100%；两家快速测试卡（条）的最低检出限分别为5 ng/mL（快灵）和4 ng/mL（拜发）.

（2）快速测试卡（条）的检测结果判定比较准确可靠，相对酶标法和高效液相色谱法，操作简单、快速，能够满足粮食基层单位现场快速检测的需要，能够对粮食中黄曲霉毒素的污染情况起到监测初筛的作用.

表11 拜发测试卡的测定结果 ng/mL

表12 整颗粒样品的快速定性检测结果 μg/kg

（3）快速测试卡（条）的检测过程中出现了一些问题：少数检测结果出现了假阳性和假阴性，测试卡（条）的检测准确性需进一步提高，特别是对临界值的判断；测试卡（条）显色结果的判断受个人主观意识的影响，能否用机器代替人来判定结果，如提供读卡器等；样品的前处理设备需进一步集成、简化，以更好地满足现场快速检验的需要.

（4）建议在进一步研究的基础上，制定粮食中黄曲霉毒素快速测试卡（条）的技术规范和检测方法标准，使该方法能在粮食质量监测中得到应用.

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VERIFICATION OF RAPID DETECTION OF AFLATOXIN B1IN GRAIN BY IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST PAPER METHOD

LIU Jian，XIONG Ning，LIU Li，YU Dun-nian
（State Grain and Oil Inspection Center of Hubei Province，Wuhan 430061，China）

In this paper，four state grain and oil inspection mechanisms carried out the feasibility verification of immunochromatographic test paper method by comparing the effects of high performance liquid chromatography and the immunochromatographic test papermethod on determ ining the aflatoxin B1in two original samples，i.e.rice and corn，contam inated by aflatoxin B1.The results showed that the consistence rate of the immunochromatographic test paper method and the high performance liquid chromatography was up to 90.5%；and the immunochromatographic test paper method was simple，accurate，convenient and rapid，and could be used for field rapid determ ination of aflatoxin B1in prelim inarily screened grain.

aflatoxin B1；immunochromatographic assay；colloidal gold；high performance liquid chromatography

TS210

B

CNKI:41-1378/N.20111028.0857.013

1673-2383（2011）05-0051-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20111028.0857.013.html< class="emphasis_bold">网络出版时间：

时间：2011-10-28 08:57:53 AM

2011-03-06

刘坚（1979-），男，湖北黄石人，工程师，研究方向为粮油食品检验.