白介素－18在大鼠视网膜新生血管形成中的作用

闾雯娟，唐 宁

（1石河子大学医学院，石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院，石河子832002）

白介素－18在大鼠视网膜新生血管形成中的作用

闾雯娟1，唐 宁2

（1石河子大学医学院，石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院，石河子832002）

为探讨白介素－18对大鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）及新生血管形成的影响。采用50只7 d龄清洁级SD大鼠幼鼠随机分为5组，即空白对照组、高氧未处理组、生理盐水实验组、高浓度实验组和低浓度实验组，建立高氧诱导的新生大鼠产生视网膜新生血管的动物模型。分别对3个给药组双眼玻璃体腔内注射生理盐水、IL－18（50 ng／μL、50 ng／μL）1μL。免疫组织化学染色法观察VEGF在视网膜各层的表达，应用CD34计算突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数，比较各组间差异。结果显示，（1）HE染色显示，各实验组均有较多新生血管内皮细胞核突破视网膜内界膜进入玻璃体腔内，但高浓度实验组及低浓度实验组明显低于生理盐水实验组及高氧未处理组，并且高浓度实验组低于低浓度实验组。（2）VEGF在各组视网膜中均有表达，在高氧组表达明显增加，IL－18给药组表达相对较弱，空白对照组最弱。（3）空白对照组极少见增生的毛细血管，其余各组发现较多CD34标记的增生的毛细血管，高浓度实验组、低浓度实验组相对较少，且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可知，IL－18玻璃体腔内注射可抑制血管内皮细胞的增殖及迁移，从而抑制视网膜新生血管的形成。

白介素－18；视网膜新生血管；血管内皮生长因子

眼内新生血管的形成是一个非常复杂的过程，可能是由于在多种细胞及其分泌的细胞因子对眼内细胞增殖的调控过程中，破坏了促血管生成因子和血管生成抑制因子间的平衡，最终导致正常组织内新生血管的长入。由于新生血管内皮细胞间隙增大引起的出血、渗出和增生常常导致眼内结构和功能的破坏终致视力的丧失。因此，抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键。随着医学分子学和病理学技术等基础医学科学的迅速发展，对抑制新生血管形成的研究有了新的进展。尤其是发现IL－18能通过抑制肿瘤组织的新生血管生成而抑制肿瘤的生长及转移［1］。近年研究还发现，白介素－18与动物新生血管性眼病的发生和发展有关［2］。因此、我们选择通过高氧诱导幼鼠视网膜新生血管形成，并采用玻璃体腔注射IL－18后取视网膜通过病理学检测，观察其对视网膜新生血管形成的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

混合气体（80%医用氧气与20%医用氮气的混合气体，由石河子大学医学院第一附属医院高压氧科提供）。自制60 c m×40 c m×30 c m透明无毒玻璃密闭箱（上方留直径10 c m的圆形开口，以便拿取动物，用大于开口的玻璃加盖。容器的两面侧壁对角线位置分别打孔，一端接进气管，连于混合气瓶；另一端接出气管，连于测氧仪。各管道连接口及盖板涂以真空硅脂，确保密闭。容器底铺钠石灰颗粒，保持容器内干燥）。氧浓度测量仪（梅城电化分析仪器厂，CY－12C），1μL微量注射器（上海生工生物技术有限公司提供），IL－18由北京博奥森生物技术有限公司提供，一抗小鼠抗大鼠mAb（VEGF购自美国neo maker公司，CD34购自北京博奥森生物技术有限公司。），SP免疫组化染色试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司产品），DAB显色液（华美公司），健康7 d龄Sprague Dawley（SD）大鼠（新疆医科大学实验动物中心提供）50只，雌雄不限。

1.2 实验动物分组及模型的制备

采用同日出生7 d的SD大鼠幼鼠50只，共100只眼，随机选取40只统一编号后置于密闭玻璃箱中，一端接进气管，连于混合气体，另一端接出气管，连于测氧仪，保持氧箱内氧浓度为750±20 mL／L，室温保持（23±2）℃，每日打开氧仓3次各2 h，将4只母鼠放入喂养并更换箱内垫料，开箱时间约1 h，氧仓中连续饲养5 d，建立高氧诱导的血管增生性视网膜病变模型，小鼠在氧仓内生长良好，无死亡现象。剩余10只为空白对照组，不给予任何处理，正常环境中饲养。建模后40只幼鼠随机分为高浓度实验组（10只）：给予双眼玻璃体内注射1μL的IL－18（50 ng／μL）。低浓度试验组（10只）：给予双眼玻璃体内注射1μL的IL－18（10 ng／μL）。生理盐水实验组（10只）：给予双眼玻璃体内注射1μL的生理盐水。高氧未处理组（10只）：双眼不给予任何处理。继续在正常环境中饲养，第21天将5组小鼠颈椎脱臼处死，摘取双眼球，分别标记方向并编号，于中性甲醛中固定48 h。

1.3 实验方法

将每组小鼠两只眼球浸泡在4%甲醛固定液中，固定48 h后常规脱水，石蜡包埋，矢状面平行视神经连续切片，厚度5μm，每只眼球选取10个切面（去掉有视神经的切面），贴于玻片上。

在H.E.染色的组织学切片上观察，在低倍镜下统计平均每张眼球切片突破视网膜内界膜而长入玻璃体内的血管内皮细胞核数。

运用免疫组化方法检测视网膜中VEGF的表达，CD34标记血管内皮细胞观察视网膜血管改变。将切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，微波抗原修复。每张切片滴加过氧化物酶阻断剂以阻断内源性过氧化物酶的活性；各组随机抽取10张切片滴加VEGF抗体，其余10张滴加人抗鼠CD34抗体；滴加聚合物增强剂；滴加酶标抗鼠聚合物；DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。

显微镜下观察，免疫组织化学阳性染色为细胞浆内棕黄色颗粒，阳性细胞判断标准：以细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞，每张切片取3～5个典型者10×40倍视野进行观察，每个视野连续计数100个细胞，根据切片上着色细胞比例不同分别标示为：阴性（－）：无着色细胞或仅有＜10%细胞着色，计为0分。弱阳性（±）：阳性细胞数10%～25%，计为1分。阳性分为：（＋）阳性细胞数25%～50%，计为2分；（＋＋）阳性细胞数50%～75%，计为3分；（＋＋＋）阳性细胞数75%～100%，计为4分；进行免疫组化定性分析。

所有记录数据整理后进行统计学处理。各组数据均用均数±标准差表示。采用统计分析软件SPSS13.0对表达结果进行统计学处理。对所测结果进行正态分析及方差齐性检验，各组差异采用单因素方差分析法，LSD检验法进行两两比较，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 组织形态学结果

空白对照组基本看不到突出内界膜的血管芽，内界膜下视网膜内的血管内皮细胞散在分布、数量较少，高氧未处理组和生理盐水实验组可见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核，内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生，高氧未处理组和生理盐水实验组突破视网膜内界膜的内皮细胞核个数与正常对照组比较差异均有显著性意义，表明该视网膜新生血管形成的动物模型诱导成功。高、低浓度实验组切片中均可见到突破视网膜内界膜的新生血管的内皮细胞核，但较高氧未处理组、生理盐水实验组及空白对照组明显减少，平均每张切片突破视网膜内界膜的内皮细胞核个数与高氧未处理组、生理盐水实验组及空白对照组比较差异均有显著性意义（表1、图1）。

表1 各实验组突破视网膜内界膜血管内皮细胞核个数Tab.1 numbers of endotheliocyte nuclei of neovascularization

图1 各组视网膜组织HE染色显微镜观察照片（400×）Fig.1 HE－staining results of each group mice retinal（400×）

2.2 视网膜VEGF蛋白免疫组织化观察及评分结果

观察及评分结果见图书室和表达式。由图2和表2可知：VEGF蛋白主要位于细胞胞浆，主要定位于视网膜内核层和神经纤维层。正常对照组VEGF蛋白表达极少，胞浆染色呈浅棕黄色；高氧未处理组、生理盐水实验组VEGF蛋白表达明显增多，胞浆染色呈棕色或深棕色；高、低浓度实验组VEGF蛋白表达减少，胞浆染色变浅，呈浅棕色。

表2 各实验组视网膜VEGF蛋白表达评分 n＝10，Tab.2 Results of immunohistochemistry of VEGF

表2 各实验组视网膜VEGF蛋白表达评分 n＝10，Tab.2 Results of immunohistochemistry of VEGF

注：＊表示各组与空白对照组之间比较P＜0.05；△表示高、低浓度实验组与生理盐水实验组、高氧未处理组之间比较P＜0.05；★表示高浓度实验组与低浓度实验组之间比较P＜0.05。

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图2 各组视网膜组织VEGF免疫组化染色显微镜观察照片（400×）Fig.2 VEGF immunohistochemistry coloured results of each group mice retinal（400×）

2.3 CD34免疫组织化染色观察及评定结果

CD34免疫组化方法标记血管内皮细胞观察视网膜血管数量和形态的改变，光镜下选取血管内皮细胞标记清晰、背景对照良好的10个HPF（400倍）计算毛细血管数的平均值。空白对照组视网膜毛细血管发育良好，内外毛细血管均达到视网膜周边部和视网膜各层，且数量较少；高氧未处理组、生理盐水实验组视网膜毛细血管增生明显，部分血管增生可延及玻璃体，可见血管扩张，部分伴有出血；高、低浓度实验组视网膜毛细血管亦增多，但较高氧未处理组、生理盐水实验组减少，且血管结构良好（表3、图3）。

表3 各实验组视网膜CD34标记血管计数Tab.3 expression of neovascularization by CD34

图3 各组视网膜组织CD34免疫组化染色显微镜观察照片（400×）Fig.3 CD34 immunohistochemistry coloured results of each group mice retinal（400×）

3 讨论

新生血管形成是新生血管性视网膜病变的重要标志，促血管生长因子增加与抑制血管生长因子减少是其主要原因，特别是某些促新生血管形成的细胞因子，控制着内皮细胞的增殖和迁移，对血管新生具有调节作用。目前研究证明，血管内皮细胞因子（VEGF）与视网膜新生血管的形成直接有关［3］。VEGF与其特异性受体VEGFR结合（包括FIt、KDR），诱导酪氨酸磷酸化，促进细胞有丝分裂，介导血管内皮细胞增生分化；其中与KDR结合可促使NO产生增加，激活环氧化酶刺激前列腺素的产生，NO和前列腺素均可使VEGF的促进血管通透性能力增强［4］。研究认为：缺氧在新生血管形成初始可能起重要作用，而VEGF在与缺氧有关的眼内新生血管化过程中起关键作用：高氧下调VEGF引起血管退化，而随后的VEGF上调导致视网膜新生血管形成［5］。目前临床上已经有多种抗VEGF的治疗，大多是通过竞争性与VEGF抗原结合，阻断VEGF与血管内皮细胞上的受体结合，从而阻断血管生成的启动，并被证实在多种视网膜血管病变中效果显著［6］。有研究报道，玻璃体内注射酪氨酸激酶抑制剂，可以阻断VEGFR酪氨酸激酶的活性，从而减少视网膜新生血管的形成［7］。本实验通过建立高氧诱导大鼠视网膜新生血管的动物模型，行玻璃体腔注射白介素－18后取视网膜组织标本，采用免疫组织化学染色定性分析视网膜VEGF的表达，根据各组视网膜中VEGF阳性表达对比结果，观察白介素－18在新生大鼠视网膜新生血管发生过程中的作用。

IL－18主要由活化的单核－巨噬细胞产生，有许多生物学活性，能通过诱导T细胞、NK细胞增殖，分泌IFN、GM－CSF，促进Fas L的表达，从而抑制血管内皮细胞生长因子VEGF、b－FGF的表达，减少肿瘤组织的新生血管生成［7］。最近的研究显示，IL－18基因敲除后的新生小鼠有视网膜血管扩展及渗漏现象，以及血管内皮细胞生长因子（VEGF），血小板源性生长因子（PDGF），碱性成纤维生长因子（b FGF）和色素上皮源性生长因子（PEDF）的过表达，并且在糖尿病大鼠中发现随糖尿病病程的发展，视网膜中IL－18的表达逐渐降低，对 VEGF、IGF－1抑制作用减弱，导致血管内皮细胞增生，新生血管形成［8－11］。

本实验研究结果显示：从视网膜形态学观察发现，正常对照组视网膜形态完好，内界膜下血管内皮细胞散在分布、数量较少。其他各组均可见较多突出内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核。但通过内皮细胞计数，我们发现高氧未处理组和生理盐水实验组突破视网膜内界膜的内皮细胞核个数最多，与空白对照组和高、低浓度实验组比较差异均有显著性意义（P＜0.001）。而通过外源性IL－18干预的高、低浓度实验组切片中突破视网膜内界膜的新生血管的内皮细胞核计数明显减少，与其余各组比较差异均有显著性意义（P＜0.05），且高浓度实验组内皮细胞核计数少于低浓度实验组（P＜0.05），说明IL－18可抑制血管内皮细胞的增殖，并随着注射浓度的增加，对视网膜血管内皮细胞核增殖及迁移的抑制作用增强。而通过免疫组织化学染色检测视网膜中VEGF与CD34的表达，进一步观察血管内皮细胞增殖及新生血管的形成，我们发现空白对照组视网膜VEGF呈弱阳性表达，主要定位于内核层和神经纤维层，高氧未处理组及生理盐水实验组呈强阳性表达，各层均有表达，以神经纤维层，内界膜层以及突破内界膜的血管内皮细胞为主，高、低浓度实验组各层均匀表达，呈现弱阳性。通过病理学评分显示高、低浓度实验组与其余各组VEGF表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），并且高、低浓度实验组间比较差异也有统计学意义，这与形态学观察结果一致，进一步说明IL－18对血管内皮细胞的抑制作用。通过CD34阳性表达，计数各组视网膜内血管数量，显示空白对照组中血管数量极少，血管形态完整。高氧未处理组及生理盐水实验组血管数量明显增多，血管腔大小、分布不均匀，血管数量与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而高、低浓度实验组血管数量相对较少，分布较均匀，血管数量与其余各组比较差异均有显著性意义，且高浓度实验组血管数量少于低浓度试验组，进一步说明IL－18可抑制新生血管的形成。本组实验研究表明，IL－18玻璃体腔注射短期内就可以抑制视网膜内皮细胞VEGF的表达，在某种程度上说明了IL－18可以通过影响血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制视网膜新生血管的形成，为视网膜新生血管性眼病的病理机制提供理论支持。

白介素－18是近年来被发现的重要多效能炎症细胞因子，与新生血管有着密不可分的关系，其机制可能包括破坏 Th1／Th2细胞比例平衡、上调ICA M、生成血管内皮生长因子等免疫调节机制及炎性应答反应［12］。目前，国内外对白介素－18在肿瘤治疗中的应用有研究较多，其作用与抑制肿瘤增殖活性及微血管生成相关［13－15］，眼科研究较少，且尚未见眼内给药的文献报道。本研究以新生SD大鼠为动物模型，通过高氧诱导新生血管形成，向玻璃体腔内注射不同浓度的IL－18，观察其对视网膜新生血管形成的抑制作用，证实白介素－18玻璃体腔注射能有效抑制氧诱导大鼠视网膜新生血管的形成。本实验还给予不同剂量白介素－18玻璃体腔注射，结果显示实验组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明白介素－18对视网膜新生血管的抑制作用具有剂量依赖性。本实验研究中白介素－18可能通过刺激Th1细胞产生IFN－γ，干扰细胞周期，抑制血管内皮细胞增值和分化，降低VEGF，从而抑制视网膜新生血管的形成。扩展了对新生血管性眼病发病机制的认识，也为其早期干预提供了可能，但是白介素－18在人类眼内给药的剂量和安全性等方面有待进一步研究。

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The Experi mental Study of Interleukin－18 Effects in Rat Retinal Neovascularization

LÜ Wenjuan1，TANG Ning2
（1 Medical of College，Shihezi University，Shihezi 832002，China；2 The First Affiliated Hospital of Medical College，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

To investigate t he effects of IL－18 on retinal neovascularization and the expression of VEGF on mice.Fifty seven－dayold neonatal SD mice were randomly divided into five gr oups：control group、NaCl group、hyper xia experi mental group，low concentration experi mental group and high concentration experi mental group.Retinalneovascularization models were induced by hyper xia in newbor n m ic.The mice in injected group were respectively treated with intravitreal injection of Nacl、interleukin－18（10 ng／μL and 50 ng／μL）1μL.The expression of VEGF at layers of retina was detected by i mmunohistochem istr y.The nu mbers of the endot heliocyte nuclei of neovascularization which broke through the retinal inner li m iting membranewere calcu－lated by CD34 in or der to evaluate inhbiting effects of the Bevacizu mab on the retinal neovascularization.（1）The nu mber of endotheliocyte nuclei of neovascularization was small in control gr oup，but in hyper xia experi mental group，low concentration experi mental group and high concentration experi mental group，there are much more endotheliocyte nuclei and the low concentration experimental group was more than in high concentration experi mental group.（2）The expression of VEGF was found at all layers of retina in each group，significantly increased in hyper xia experi mental group，relatively decreased in high and low dose experi mental group，and was the lowest in control group.（3）The expression of neovascularization by CD34 was found at all layers of retina in each group，significantly increased in hyper xia experi mental group and NaCl group，relatively decreased in high and lo w concentration experi mental group，and was to the lowest in control group.There was significant differences for low and high concentration experi mental group compared（P＜0.05）.Interleukin－18 can inhibit the endotheliocyte nuclei proliferation and migration，effectively inhibit the retinal neovascularization.

book=323,ebook=222

Interleukin－18；Neovascularization；vascular endothelial growth factor

R774

A

1007－7383（2011）03－0322－06

2010－12－10

闾雯娟（1984－），女，硕士生，专业方向为眼肌病及眼底病。

唐宁（1969－），女，副教授，从事眼底疾病与眼肌疾病研究；e－mail：tangning555＠s163.co m。