高效毛细管电泳法分离检测人体血浆中盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因

李险峰，朱平川

（1.惠州学院化学工程系，广东 惠州516007；2.广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，广西 南宁530005）

高效毛细管电泳法分离检测人体血浆中盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因

李险峰1，朱平川2

（1.惠州学院化学工程系，广东 惠州516007；2.广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，广西 南宁530005）

建立毛细管区带电泳同时测定人体血浆中盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因含量的方法.在75μm I.D×60cm未涂层石英毛细管中，以30mmol／L Tris－HCl为电泳缓冲溶液，分离电压为22kV时，两种被测组分在5 min内达到基线分离.盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因的检出限分别为0.50、0.30μg／mL，样品加标回收率在88%～95%之间，相对标准偏差（RSD）均小于5%.该方法简便、快速、准确，并成功用于人体血浆样品的分析.

毛细管电泳；盐酸伪麻黄碱；磷酸可待因；人体血浆

盐酸伪麻黄碱是中草药麻黄中提取的胺类生物碱，具有松弛平滑肌，兴奋中枢神经，发汗解热等作用［1］，中枢神经兴奋作用远较肾上腺素强.磷酸可待因也是药物中常见的生物碱，研究表明，具有多种生理活性和药理疗效［2］，如镇静、镇痛、镇咳及抑制呼吸等.但是这两种生物碱都具有一定的毒性和麻醉性.

近年来，吸毒和药物滥用对人们的生活和社会安定构成了极大威胁，因此发展准确、灵敏、简便的检测血浆等体液中毒品及麻醉类物质的分析方法具有重要意义.上述两种常见生物碱检测方法已有报道，如高效液相色谱法［3］及毛细管电泳法［4］，毛细管电泳－电致化学发光法［5］以及液相色谱－质谱法［1］等.其中毛细管电泳（CE）由于具有分离效率高、速度快及样品消耗少等优点而被广泛应用于尿样、血清及单细胞等生物样品的分离分析［6－8］.文中提出了一种毛细管电泳同时分离检测盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因的新方法，对电泳分离条件的影响进行系统优化，并将该方法成功应用于人血浆样中此两种物质含量的分析.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂美国Beckman公司P／ACETM MDQ毛细管电泳系统，二极管阵列检测器；工作站：32Karat TM，未涂层弹性石英毛细管（75μm I.D×60cm，有效长度50cm）（河北永年锐沣色谱器件有限公司）；Thermo Orion 720A型酸度计／离子计（美国）；MILLIPORE超纯水系统（美国）；Sartorius ME 215S电子天平（德国）；Eppendorf Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机；KQ2200DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；三（羟甲基）氨基甲烷（生化试剂BR；国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯，所用水为超纯水；对照品盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因购自中国药品生物制品检定所.

1.2 溶液配制标准溶液的配制：准确称取盐酸麻黄碱、磷酸可待因对照品各10.0mg，置于10mL量瓶中，用水溶解并定容，配成1.00mg／mL的对照品储备液，密封于4℃下冰箱中保存.

1.3 血浆的预处理抽取健康青年志愿者血液3mL，加肝素抗凝，于3 500r／min离心10min，上层清液即为血浆.取空白血浆和加标血浆200μL于试管中，加入0.1mol／L NaOH 50μL，乙酸乙酯2mL，涡旋振荡5min，于12 000r／min离心10min，取出乙酸乙酯层于试管中.此过程重复3次，所得乙酸乙酯溶液合并在一起，于80℃水浴中氮气吹干，然后用200μL甲醇冲洗试管壁收集样品后蒸干，残余物用200μL水溶解.

1.4 电泳分离条件以30mmol／LTris－HCl（pH＝8.0）为电泳介质，未涂层弹性石英毛细管（75μmI.D×60cm）为分离通道，压力进样（0.5psi×6sec），分离电压为22kV，分离温度为25℃，检测波长为214nm.实验前缓冲溶液用0.45μm滤膜过滤，并用超声波脱气5min.毛细管在使用前，用0.1mol／L氢氧化钠冲洗10min，然后用水和缓冲溶液各冲洗5min.每两次运行之间用缓冲溶液冲洗3min.更换缓冲溶液时先用超纯水和新的缓冲溶液各冲洗5min.

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的优化

2.1.1 缓冲体系的选择 分别考察了 Tris－H3BO3、Tris－H3PO4、Tris－HCl、Tris－柠檬酸（Cit）缓冲体系（pH＝8.0）对分离的影响.结果表明：在Tris－H3BO3，Tris－柠檬酸（Cit）体系中盐酸伪麻黄碱灵敏度低，磷酸可待因峰形很宽；Tris－H3PO4体系中磷酸可待因峰灵敏度低，而在Tris－HCl体系中盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因能够得到比较好的分离.因此选择Tris－HCl体系为运行缓冲溶液.

2.1.2 缓冲溶液中Tris浓度对分离的影响 实验考察了Tris浓度在20～60mmol／L范围内对分离的影响，实验发现随着Tris浓度的增大，各组分的分离度无明显改善，只影响各组分的出峰时间.当Tris浓度高于60mmol／L时，各峰的迁移时间延长，焦耳热效应增加，造成基线噪音增加；当Tris浓度为30mmol／L时，各物质间分离度最好，迁移时间也较短.因此选定Tris浓度为30mmol／L.

2.1.3 缓冲溶液pH值对分离的影响 缓冲液的pH不仅会影响电渗流的大小，而且还影响到被测物的有效电荷数，因此通过调节缓冲液的pH值可以改变分析物的迁移行为和分离效率.实验考察了pH从6到9范围内pH变化对各峰的影响，当pH小于6时它们之间的分离度有所增加，但迁移时间不断延长；pH超过9之后，磷酸可待因的峰形变差.综合考虑，本实验选择pH＝8.0.

2.1.4 电压对分离的影响 实验考察了15～30kV范围内分离电压对迁移时间和峰形的影响，结果表明：随着分离电压的升高，样品的分析时间缩短，峰形尖锐.当分离电压达到30kV时，前两峰的分离度变小，且基线也变得不太平稳，重复性差.在保持分离度及维持良好峰形的前提下，以22kV时分离效果最佳，盐酸麻黄碱和磷酸可待因组分在5min内可获得很好的基线分离.

2.1.5 进样时间对分离的影响 固定0.5Pa的压力进样，在5～10s范围内改变进样时间.实验表明进样时间越长，灵敏度越高.但随着进样量的增大，溶质区带加宽，分离度下降，峰形变差.综合考虑各因素，选择进样时间为6s.

图1 空白血浆（a）和浓度为10mg／L的盐酸伪麻黄碱（峰1）和磷酸可待因（峰2）（b）的加标血浆CE图

2.2 线性关系与检出限在最优条件下，由对照品贮备液精确配制成不同质量浓度的系列混合溶液于优化后的条件下进行电泳分析.分别重复进样5次，工作曲线、线性范围、相关系数和检出限（S／N＝3）分别为：盐酸伪麻黄碱，y＝317x＋469.82，2～300 mg／L，R＝0.999 1，0.5mg／L；磷酸可待因，y＝833.33x＋1 612.6，1～300mg／L，R＝0.998，0.3mg／L.

表1 盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因在人血浆中的回收率（n＝5）

2.3 样品测定为了消除血样中无机盐和蛋白质对测定的干扰，空白人血浆和加标人血浆均以1.3方法进行处理，在最佳检测条件下，利用毛细管电泳法对血浆中的盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因进行测定，在空白血浆中没有检测出此两种物质，将分别含有10mg／L盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因的加标血浆样品连续进样5次，测得盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因的RSD分别为4.6%和4.8%，结果如图1所示.从图中可以看出，血浆中的杂质不干扰两种物质的测定.这两种物质的回收率结果见表1.

3 结论

文中提出运用毛细管电泳对盐酸伪麻黄碱和磷酸可待因进行分离检测，并将此法应用于人血浆中测定，血浆中杂质不干扰两种被测物质的分离检测.该方法灵敏、简单、快速、可靠，并有望用于该药物的药代动力学等方面的研究.

［1］郭俊峰，杨冀州，李淑娟.液相色谱－质谱／质谱法快速测定保健品中违禁成分麻黄碱、伪麻黄碱和盐酸芬氟拉明［J］.中国国境卫生检疫杂志，2008，31（6）：415－417.

［2］高利娜，刘俊亭，王永明，等.止咳糖浆中磷酸可待因含量的测定［J］.药物分析杂志，2007，27（11）：1738－1741.

［3］王慧，毛睿.复方磷酸可待因糖浆中4种成分的含量测定［J］.药物分析杂志，2009，29（10）：1689－1891.

［4］罗金文，朱海霖，李会林.流动注射－毛细管电泳分流式电动进样歧视效应特征的研究［J］.色谱，2005，23（2）：189－192.

［5］刘彦明，田伟.毛细管电泳电致化学发光灵敏检测毒品类生物碱及在尿样分析中的应用［J］.高等学校化学学报，2009，30（1）：51－53.

［6］Deng B Y，Li X F，Zhu P C，et al.Speciation of magnesium in rat plasma using capillary electrophoresis－inductively coupled plasma－atomic emission spectrometry［J］.Electrophoresis，2008，29（7）：1534－1539.

［7］Deng B Y，Shi A H，Li L Q，et al.Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection［J］.J Pharmaceut Biomed Anal，2008，48：1249－1253.

［8］Deng B Y，Zhu P C，Wang Y Z，et al.Determination of free calcium and calcium－containing species in human plasma by capillary electrophoresis－inductively coupled plasma optical emission spectrometry［J］.Analytical Chemistry，2008，80（15）：5721－5726.

Simultaneous determination of pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in human plasma by capillary electrophoresis

LI Xianfeng1，ZHU Pingchuan2
（1.Department of Chemical Engineering，Huizhou University，Huizhou 516007，China；2.Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bio－resources Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning 530005，China）

A capillary zone electrophoresis method was established for the simultaneous determination of pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in human plasma.Optimized separation was achieved on an uncoated fused silica capillary（75μm I.D×60cm）using 30mmol／L Tris－HCl as the running buffer（pH＝8.0）.Under the optimized operated conditions，applied voltage of 22kV and detection wavelength of 214nm，baseline separation of each component in 5minutes had been obtained.The detection limits for pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate were 0.50，0.30μg／mL，respectively.The average recoveries were between 88%－95%and the relative standard deviations were less than 5%，the method was successfully applied to the determination in human plasma sample.

capillary electrophoresis；pseudoephedrine hydrochloride；codeine phosphate；human plasma

O657.8

A

1000－2375（2011）04－0525－03

2011－04－08

惠州学院科研项目（C210·0222）资助

李险峰（1980－），男，硕士，实验师，E－mail：wind9425＠163.com

（责任编辑 胡小洋）