VC磷酸酯的HPLC分析

张会轻，袁立国，王淑华，王云霞

（河北维尔康制药有限公司，河北石家庄 050031）

VC磷酸酯的HPLC分析

张会轻，袁立国，王淑华，王云霞

（河北维尔康制药有限公司，河北石家庄 050031）

建立了高效液相色谱法（HPLC）测定L－抗坏血酸－2－磷酸酯含量的分析方法。采用Agilent Eclipse XDB C18分析柱（250mm×4.0mm，5μm），以甲醇－0.1mol/L磷酸二氢钾（pH 值为4.4）为流动相，二者体积比为35∶65，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm。在此色谱条件下，L－抗坏血酸－2－磷酸酯在0.01～0.10mg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.999 9，样品平均回收率为98.24%。

VC磷酸酯；高效液相色谱法；VC

VC 磷 酸 酯 （L－ascorbic acid－2－phosphate，APP）又名L－抗坏血酸－2－磷酸酯，是 VC的稳定衍生物，是以VC为原料用现代科学技术加工而成的。VC磷酸酯耐受高温、高压、高湿等恶劣条件，其抵御饲料存贮过程中复杂环境的能力大大超过结晶VC和包膜VC。无论是在制粒过程中还是在调质膨化过程中，L－抗坏血酸－2－磷酸酯的保存率都大于90%［1］。VC磷酸酯的主要构成成分是VC和磷。VC磷酸酯具有VC的所有功效，又克服了VC易受光、热、金属离子等作用而氧化的缺点，因此在饲料中添加该产品不但不会改变饲料的质量，而且可以增加饲料的营养价值，是水产养殖的优选添加剂。但是，VC的化学活性高，不稳定，极易被氧化分解，从而失去VC的功效，在高温或光照下分解更快，在高温的酸性介质中容易脱水而失去活性［2－3］。与VC相比，VC磷酸酯具有下列优点：1）化学性质稳定，不易氧化；2）对热稳定性高；3）生物利用度高，VC磷酸酯可以被生物体内的磷酸酶分解，具有与VC相同的生物效价。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

VC磷酸酯标准品（纯度＞99%，北京贝丽莱斯生物化学有限公司提供）；甲醇（色谱纯）；纯化水。

WATERS高效液相色谱仪，2487紫外检测器。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18分析柱（250 mm×4.0mm，5μm）；流动相：甲醇－0.1mol/L磷酸二氢钾（pH值为4.4，二者体积比为35∶65）；紫外测定波长为254nm；流速为1.0mL/min；进样20μL。

1.3 流动相配制

精密称取13.609g（0.1mol）磷酸二氢钾，用纯化水溶解并定容至1L，用85%（体积分数）磷酸调节pH值至4.4，即得0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液（pH值为4.4）。用有机膜过滤，超声溶解20min，备用。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用流动相作为背景缓冲液，用二极管阵列检测器对L－抗坏血酸－2－磷酸酯标准液和样品溶液在190～400nm进行全波长紫外扫描。结果表明，L－抗坏血酸－2－磷酸酯在254nm处有最大吸收，且杂峰干扰少，本实验选择检测波长为254nm。

2.2 标准曲线绘制和检出限

准确称取3－环己胺－抗坏血酸－2－磷酸酯（纯度大于99.0%）标准品0.316g，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容在100mL棕色容量瓶中。其中L－抗坏血酸质量浓度为1.0mg/mL。分别移取上述溶液1.0，2.0，4.0，5.0，10.0mL，置于100mL棕色容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容，配成0.01，0.02，0.04，0.05，0.10mg/mL（以L－抗坏血酸质量浓度计）的标准工作溶液。按1.2色谱条件测定，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制工作曲线，见图1。结果表明，线性范围为0.01～0.10mg/mL时呈现良好的线性关系，回归方程为Y＝8 148.3X－14.092，R2＝0.999 9。

图1 标准工作曲线Fig.1 Standard curve

2.3 精密度实验

配制质量浓度为0.05mg/mL的VC磷酸酯标准品溶液，重复进样5次，每次20μL，测定其峰面积，计算RSD值为0.113%。计算结果见表1。

表1 精密度结果Tab.1 Results of precision

2.4 稳定性实验

配制质量浓度为0.05mg/mL的VC磷酸酯标准品溶液，在室温下每隔2h测定一次溶液中VC磷酸酯的含量，计算RSD值为0.503%（见表2）。结果表明：VC磷酸酯在流动相溶液中6h内是稳定的。

表2 稳定性实验Tab.2 Test of stability

2.5 加样回收率实验

取已知含量试样，向其中加入定量的标准品溶液，进行色谱分析测定，加样回收率平均值为98.24%，计算结果见表3。

表3 加样回收率结果Tab.3 Results of recovery

2.6 样品的测定

准确称取样品0.020 0g，放入100mL棕色容量瓶内，用流动相溶解，超声时间为10min，用0.45 μm的滤膜过滤，按1.2色谱条件进样，用外标法进行计算。由实验得知，标准品谱图（见图2）与色谱图（见图3）保留时间相一致。

图2 L－抗坏血酸－2－磷酸酯标准品谱图Fig.2 Chromatograms of standard of L－ascorbic acid－2－phosphate

图3 L－抗坏血酸－2－磷酸酯样品谱图Fig.3 Chromatograms of sample of L－ascorbic acid－2－phosphate

［1］程 恩，宋国梁，路文江.高效价L－抗坏血酸－2－磷酸酯的稳定性研究［J］.河北化工，2001（4）：19－20.

［2］CHARLES W D.Method of Preparation of Phosphate Ester of AscorbicAcid［P］.US：4179445，1979－06－02.

［3］CHEN L，SEIB P A，LIANG Y T，et al.Chemical synthesis of several phosphoric esters ofL－ascorbic acid［J］.Carbohydr Res，1978，67（1）：127－138.

HPLC analysis ofL－ascorbic acid－2－phosphate

ZHANG Hui－qing，YUAN Li－guo，WANG Shu－hua，WANG Yun－xia
（Hebei Welcome Pharmaceutical Company Limited，Shijiazhuang Hebei 050031，China）

A phase high performance liquid chromatographic method has been developed for the determination ofL－ascorbic acid－2－phosphate.Agilent Eclipse XDB C18（250mm×4.0mm，5μm）column is used and the mobile phase is the mixture of methanol－0.1mol/L phosphoricacid two hydrogen potassium buffer solution（35︰65，V/V）.The flow rate is 1.0mL/min，and the detection wavelength is 254nm.The linear range is 0.01～0.10mg/mL，and the related coefficient is 0.999 9，the average recovery rate ofL－ascorbic acid－2－phosphate in the samples is 98.24%.

L－ascorbic acid－2－phosphate；HPLC；vitamin C

TQ443

A

1008－1534（2011）06－0364－02

2011－06－03；

2011－09－20

张士莹

张会轻（1977－），女，河北石家庄人，工程师，主要从事药物研发与分析方面的工作。