扩增cca R基因提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

左志晗，郑津辉

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市细胞遗传与分子调控重点实验室，天津 300387）

扩增ccaR基因提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

左志晗，郑津辉

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市细胞遗传与分子调控重点实验室，天津 300387）

在棒状链霉菌B71－14中扩增对克拉维酸具有正调控作用的基因ccaR，构建了ccaR的重组质粒pSET152－ccaR，通过接合转移将重组质粒pSET152－ccaR转入了S.clavuligerusB71－14中，通过pSET152－ccaR中的att P位点整个质粒插入到S.clavuligerusB71－14基因组中的attB位点，实现了S.clavuligerusB71－14基因组DNA中增加一个拷贝ccaR基因的目的，所得突变株S.clavuligerus：：ccaR产酸量可达820.91 mg／L，较出发菌株提高了54%.

克拉维酸；棒状链霉菌；ccaR［Q812］

克拉维酸是棒状链霉菌的代谢产物，又名棒酸，结构式如下.

其本身抗菌活性很弱，但具有强力、广谱且不可逆的β－内酰胺酶抑制活性.大量体外抗菌作用研究表明，β－内酰胺酶抑制剂与β－内酰胺类抗生素联合应用可增强后者的抗菌活性.

由于抗生素的大量使用，导致很多细菌产生了抗药性，这己成为临床上治疗细菌性疾病的一个越来越棘手的问题.克拉维酸同β－内酰胺类抗生素联合使用既抑制了β－内酰胺酶的活性，又增强了这类抗生素的广谱抗菌作用，可有效解决产酶细菌的耐药性问题.但当前我国临床上使用的复方β－内酰胺类抗生素来源主要依赖进口产品，其主要原因是菌株的产酸能力差，因此如何获取高产菌株是解决这种现状的关键.随着链霉菌分子生物学技术的发展，以及克拉维酸代谢途径和相应基因簇的进一步揭示，通过基因工程的手段来获取高产菌株已成为可能［1］.

目前，克拉维酸生物合成途径的基因簇己经被阐释.克拉维酸合成具有独立的代谢途径，它以D－3－磷酸甘油醛和精氨酸为前体物质［2］，依次在ceaS，bls，pah，cas和oat等基因编码酶的作用下合成，Kapil等［3］研究还发现参与克拉维酸生物合成的上述基因均具有与之相似的同源基因，且相互同源的基因分别集中在两套平行的基因簇内：一套包括ceaS1，bls1，pah1 和oat1 等 基 因；另 一 套 包 括ceaS2，bls2，pah2，cas2和oat2等基因，且两套基因簇中的基因排列顺序非常相似.

除上述基因外，在棒状链霉菌中，抗生素及克拉维酸的合成受到按级别排列的一系列基因的调控，故某些调控基因的变化可能会使克拉维酸产量获得提高［4］.

ccaR是棒状链霉菌克拉维酸生物合成的调节基因之一，位于棒状链霉菌头霉素C基因簇lat基因下游4 kb处，编码由256个氨基酸组成的类ActII－ORF－4调控蛋白.ccaR的作用是结合于cefD－cmcl基因之间的双向启动子上，对于头霉素C和克拉维酸生成途径的中、下游所需要酶的转录过程起到调节作用.它还可以结合在自身的启动子上，是一个正调节因子.ccaR的突变将导致头霉素C和克拉维酸或其它棒烷类合成的停止；当回补ccaR基因后，头霉素C和克拉维酸的合成得以恢复；尽管头霉素C和克拉维酸这两个β－内酰胺类物质的合成途径截然不同，但当增加ccaR拷贝数后，头霉素C和克拉维酸的产量都将成倍增加［5］.

本研究选取棒状链霉菌的ccaR为目标基因，构建了含ccaR基因的重组质粒pSET152－ccaR，对棒状链霉菌的ccaR基因进行了扩增，并对所得的突变菌株的克拉维酸产量变化进行了研究.

1 实验材料与方法

1.1 质粒、菌株及培养基

棒状链霉菌S.clavuligerusB71－14（紫外诱变获得的克拉维酸高产菌株），用于接合转移的E.coliET12567／p UZ8002以及E.coliDH5α均为本实验室保存菌种.

PCR产物克隆载体 p UCm－T（AmpR），购自Sangon公司；大肠杆菌 －放线菌穿梭质粒载体pSET152，含有接合转移起始位点（RK2ori T）、阿泊拉霉素抗性基因（aacC4）和特异整合位点att P，由加拿大阿尔伯塔大学Annie教授惠赠.

E.coliET12567／p UZ8002 以 及E.coliDH5α所用为LB培养基［6］；棒状链霉菌所用产孢培养基为YMGA培养基［7］，种子培养采用TSB培养基，发酵培养采用SS培养基［8］.大肠杆菌－链霉菌接合培养基采用改良 AS－1培养基（g／L）［9］，即在每升AS－1培养基中添加5 g蛋白胨及0.5 g葡萄糖.

以上所用培养基中，在培养带有质粒的抗性菌株时培养基中抗生素的使用浓度如下：氨苄青霉素终质量浓度为100μg／m L，阿泊拉霉素为25μg／m L，卡那霉素为50μg／m L，氯霉素为25μg／m L，萘啶酮酸为25μg／m L.

1.2 DNA体外重组

大肠杆菌中质粒DNA的提取、限制性内切酶消化、连接、PCR以及转化等操作均按Sambrook等［10］的方法进行.

棒状链霉菌中质粒及染色体的提取按Kieser等［8］的方法进行.

1.3 cca R的测序

以ccaR的上下游引物做测序引物，采用Sanger双脱氧末端终止法进行核苷酸序列测定，测序反应委托Sangon公司完成.测序结果在GenBank进行序列比对（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）.

1.4 重组质粒向S.clavuligerus B71－14的转移

重组质粒向S.clavuligerusB71－14的转移采用Kieser等［8］介绍的接合转移的方法，即以E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 为 供 体 菌 株，将重组质粒转移至S.clavuligerusB71－14中.

1.5 发酵液中克拉维酸的生物检测及HPLC分析

以克雷伯氏肺炎杆菌KlabsiellapneumoniaeATCC29665作为克拉维酸生物活性鉴定指示菌［11］.

发酵液于10 000 r／min离心10 min，所得上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，按1∶5的比例与咪唑溶液混匀，30℃反应12 min后冷却到20℃，生成的衍生物采用Shim－pack VP－ODS（150×4.6）C18色谱柱进行 HPLC分析［12］.

2 实验结果

2.1 cca R基因的获得

将ccaR的测序结果在GenBank上做序列比对，结果证明，PCR获得的ccaR与棒状链霉菌标准菌株NRRL 3585具有99.93%的同源性，证明所得的PCR产物正确，可以用于重组质粒的构建.

2.2 重组质粒pSET152－cca R的构建

参照文献［13］报道的棒状链霉菌调节基因ccaR的相应核苷酸序列，设计合成如下引物（引物委托北京奥科生物工程有限公司合成）：引物1：5’－TAGGGAGGGGAGAGTCCGA－3’； 引 物 2： 5 ’－TTCAGCGTTGGTTCAGGGA－3’.以棒状链霉菌的染色体为模板，PCR扩增得到1.4 kb的一段含上游启动区的ccaR基因片段，将该片段经PCR产物回收试剂盒纯化与p UCm－T载体进行连接，得到重 组 质 粒 p UCm－T－ccaR；对 p UCm－T－ccaR 进 行EcoRI－BamHI酶切，回收1.4 kb的ccaR 基因片段，与经过同样酶切的载体pSET152进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，经质粒提取，对重组质粒进行酶切验证，载体的构建过程及验证结果见图1和图2.

图1 重组质粒pSET152－cca R的构建过程Figure 1 Construction of the recombinant plasmid pSET152－cca R

图2 重组质粒pSET152－cca R的验证Figure 2 Verification of recombinant plasmid pSET152－cca R

由图2可知，采用EcoRI酶切pSET152－ccaR后得到一条1.4 kb的DNA片段和一条5.5 kb的DNA片段，分别与ccaR基因及载体pSET152的大小相吻合，与理论值相符.并且以待验证的pSET152－ccaR质粒为模版，PCR扩增ccaR基因的引物和条件进行PCR扩增，结果能得到1.4 kb的ccaR基因片段，表明此重组质粒为正确的重组质粒pSET152－ccaR.

2.3 pSET152－cca R向棒状链霉菌的接合转移

将验证正确的pSET152－ccaR电转至E.coliET12567／p UZ8002 中，所 得 的 转 化 子E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 与S.clavuligerusB71－14进行接合转移，从AS－1培养基中挑取单个接合子至含有萘啶酮酸（25μg／m L）和阿泊拉霉素（25μg／m L）的营养琼脂平板上，再影印至含有和不含有卡那霉素（50μg／m L）的营养琼脂平板上.最后，挑选出抗阿泊拉霉素但对卡那霉素敏感的菌株即为接合子.提取接合子中的质粒进行验证，结果与由大肠杆菌中所提取的质粒相一致，表明重组质 粒 pSET152－ccaR 已 转 入S.clavuligerusB71－14中.

2.4 转化子的验证

载体pSET152含有一个att P位点，可以特异性地插入到链霉菌基因组中的att B位点，重组质粒pSET152－ccaR 转入S.clavuligerusB71－14后，将以整合到基因组上的插入方式将其携带的ccaR同时插入到S.clavuligerusB71－14的attB位点（图3），从而使其增加了一个拷贝的ccaR基因.

图3 pSET152－cca R 插入 S.clavuligerus B71－14染色体的示意图Figure 3 Procedure of pSET152－cca R inserted intochromosome of S.clavuligerus B71－14

将上述接合平板上长出的阿泊拉抗性菌落转接于含相应抗生素的YMGA平板上，28℃培养3～5 d，直至孢子出现，收集孢子，将孢子在不含抗生素的YMGA培养基上进行松弛培养，并在该培养基上传代3次，仍具有抗性的菌株即为插入了重组质粒pSET152－ccaR的菌株，将该突变株命名为S.clavuligerus：：ccaR.

根据棒状链霉菌attB位点两侧的序列设计一对 引 物 （图 4）P1：5’－AGCGGCCAAAGGGAGCAGACTGTAA－3’；P2：5’－CAGGATTCGAACCTGGGAAGGCTGA－3’，分别以S.clavuligerus：：ccaR及出发菌株S.clavuligerusB71－14的基因组DNA为模板，进行PCR验证，结果如图4.

由图4可知，以S.clavuligerus：：ccaR的基因组DNA为模板的PCR产物在6～7 kb之间，与理论值6.9 kb（6.9 kb的pSET152－ccaR插入S.clavuligerus的attB位点）相吻合；而以出发菌株S.clavuligerusB71－14的基因组DNA为模板不能得到PCR产物（att B两引物之间只有60 bp），说明S.clavuligerus：：ccaR为pSET152－ccaR整合插入到S.clavuligerusB71－14的attB位点所得的突变株.

图4 突变株S.clavuligerus：：cca R的PCR验证Figure 4 PCR verification of S.clavuligerus：：cca R

2.5 S.clavuligerus：：cca R产酸能力的测定

挑取突变菌株及一株原始对照菌株在豆粉培养基中分别进行发酵培养，测定发酵液中的克拉维酸含量，结果突变菌株的克拉维酸产量最高（表1中M－1）可达820.91 mg／L，较原始对照菌株提高了54%（表1）.

表1 突变菌株及原始菌株发酵液中克拉维酸产量的HPLC测定结果Table 1 HPLC analysis result of clavulanic acid production of original strain and the mutants

2.6 S.clavuligerus：：cca R的遗传稳定性实验

将表1中产酸量最高的突变株M－1在YMGA培养基斜面上进行传代培养，每转接一次同时转入发酵培养基中，摇瓶发酵后HPLC法测定克拉维酸的效价，结果如表2所示.

表2 S.clavuligerus：：cca R的遗传稳定性Table 2 Hereditary stability of S.clavuligerus：：cca R

由表2的传代实验结果可知，S.clavuligerus：：ccaR在5代之内产酸量较稳定，继续传代，则菌种的产酸量下降较明显，所以应尽量控制传代次数在5代以内.

3 结果与讨论

随着克拉维酸生物合成途径及基因调控的逐渐明确，在常规诱变、原生质体融合的基础上可以寄希望于通过基因工程的方法来获得克拉维酸高产菌株［4］.

头霉素C是棒状链霉菌的抗生素类代谢产物之一，与克拉维酸的代谢途径彼此独立又关系密切，克拉维酸合成酶基因簇和头霉素C合成酶基因簇相邻，且受相同的调节基因ccaR的调控，而棒状链霉菌中一种代谢产物的阻断往往会导致其它代谢产物产量的提高［14］.基于上述原因，Paradkar等［15］对野生型棒状链霉菌的lat基因进行插入突变，该基因编码赖氨酸ε－转氨酶（该酶是头霉素C合成途径中的关键酶）［16］，结果获得了头霉素C合成停止而克拉维产酸量为原始菌株的2.5倍的高产菌株，是采用基因工程的方法对棒状链霉菌进行改造的成功典范.国内王永华［17］、舒杨等［18］也曾采用类似的方法分别获得了克拉维酸产量分别为原始菌株1.8倍和2.67倍的高产突变株.

本课题曾选择对棒状链霉菌进行紫外诱变获得了产量为原始菌株1.91倍的高产菌株S.clavuligerusB71－14［19］，并对该诱变高产菌株进行了lat基因的插入突变，获得了产酸量进一步提高的工程菌株［20］.在前面研究的基础上，本研究尝试在高产菌株S.clavuligerusB71－14中扩增对克拉维酸合成具有正调控作用的调节基因ccaR，以期为构建棒状链霉菌高产菌株提供又一可行途径.

本实验尝试增加棒状链霉菌中的ccaR基因拷贝以提高克拉维酸的产量，构建了重组质粒pSET152－ccaR，并将其转入E.coliET12567中获得了接合转移的供体菌E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR，通过大肠杆菌与棒状链霉菌的接合转移实验成功的将重组质粒pSET152－ccaR转入了S.clavuligerusB71－14中，由于载体pSET152含有一个att P位点，可以特异性的插入到链霉菌基因组中的att B位点，实现了在S.clavuligerusB71－14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的，该方式是整合到基因组上的插入方式，所构建的基因工程菌株稳定性较高，易于进行工业化生产，为棒状链霉菌克拉维酸高产菌的选育提供了又一可行性途径.

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Study on application ofccaRStreptomycesclavuligerusto increase clavulanic acid production

ZUOZhihan，ZHENGJinhui

（a.College of Life Science，b.Tianjin Key Laboratory of Cyto－Genetical and Molecular Regulation，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Clavulanic acid positive regulation geneccaR was amplified inStreptomycesclavuligerusB71－14.ccaR expression plasmid pSET152－ccaR was constructed and transformed intoS.clavuligerusB71－14 by conjugation.Theatt Psite in pSET152－ccaR could be inserted intoattBsite ofS.clavuligerusB71－14，and an extra copy ofccaR was inserted into the chromosome ofS.clavuligerusB71－14.The clavulanic acid yield of the obtained mutantS.clavuligerus：：ccaR can reach 820.91 mg／L，which is 1.54 times of that withS.clavuligerusB71－14.The yield is steady within five generations.

clavulanic acid；Streptomycesclavuligerus；ccaR

Q939.9

A

1671－1114（2011）04－0064－06

2010－04－07

天津师范大学博士基金资助项目（52X0910）

左志晗（1979），女，讲师，博士，主要从事微生物活性物质开发方面的研究.

（责任编校 纪翠荣）