Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究*

黄大林 戴支凯 王 鑫 李彬彬 钟 江

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究*

黄大林 戴支凯 王 鑫 李彬彬 钟 江△

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达重组鼠白细胞介素（IL）-2蛋白。方法：用Flag标记鼠IL-2并加入真核细胞启动子CMV，构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定；将鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中，将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中，筛选阳性克隆，获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2，抽提质粒；用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒，收获重组杆状病毒，将构建病毒转导BHK细胞培养，用Western blot检测IL-2蛋白。结果：通过杆状病毒表达系统，在BHK细胞成功表达重组的鼠IL-2蛋白。结论：重组杆状病毒在真核细胞中成功表达重组鼠IL-2蛋白。

白细胞介素2 重组蛋白质类 杆状病毒科 遗传载体 质粒 聚合酶链反应 小鼠,近交系

20世纪90年代出现的Bac-to-Bac商业化系统，成功地将杆状病毒-昆虫细胞表达系统变为具有广泛用途的系统，通过这个系统将外源基因定向重组克隆到杆状病毒基因组上多角体启动子后，成功构建杆状病毒的穿梭质粒。提取穿梭质粒，即病毒基因组提取出来，转染昆虫细胞就可以得到重组病毒。随着Bac-to-Bac应用范围越来越广，现在已经发展出一系列用于定向转座的供体质粒，甚至能利用杆状病毒在昆虫细胞中同时表达多个蛋白。迄今已经成功表达了许多外源基因，例如鸡胃酶解肌球蛋白[1]、视紫质激酶[2]、人类干扰素-β[3]等。笔者使用Bac-to-Bac系统构建鼠白细胞介素-2（IL-2）基因杆状病毒表达载体并在哺乳动物细胞表达重组构建鼠IL-2蛋白，报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒 大肠杆菌JF1125；昆虫细胞草地夜蛾（Spodoptera frugierda）卵巢组织细胞系Sf9，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）；pFastBacDual质粒，pFastTATBacDu⁃al质粒及T-CMVp，幼仓鼠肾细胞（BHK）等由复旦大学微生物学与微生物工程系钟江课题组实验室保存提供。

1.2 试剂与仪器 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和碱性磷酸酶购自TaKaRa大连宝生物工程公司；TNM-FH培养液由购自Sigma公司的粉剂配制，加10%的小牛血清使用。转染试剂CellFectin购自Invitrogen公司；RMPI 1640培养液购自杭州吉诺公司；DNA凝胶回收试剂盒以及PCR产物回收试剂盒购自上海杰瑞生物科技有限公司；细胞总RNA抽提试剂盒和反转录试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ购自MBI Fermentas公司，DL2000购自物TaKaRa公司，RNase A购自上海华舜生物工程有限公司；预染蛋白Marker（mid）购自北京鼎国昌盛生物公司；Taq DNA polymerase购自北京天根公司；蛋白酶K购自Roche公司；F-7425 Anti-Flag和羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司。GNP-9080型隔水式恒温培养箱；HZ-9211K恒温细菌培养摇床；81-2型恒温磁力搅拌器，DK-8D型电热恒温水槽；无菌操作台；Eppendorf台式高速离心机（Centrifige 5415D）；PCR仪（Thermo Life Science）；YLN-2000 DNA 凝胶成像仪；DYY-2C型DNA电泳仪；BIO-RAD POWER PAC3000蛋白电泳仪；Nikon倒置显微镜（FX35A）；SHP-150型生化培养箱，Thermo Scientific Series CO2培养箱。

1.3 方法

1.3.1 小鼠IL-2基因的获得及鉴定 采用SPF级40日龄的昆明小鼠购自复旦大学上海医学院实验动物科学部，平均体质量为(22.08±3.00)g。拉颈处死小鼠，打开腹腔，无菌取出小鼠脾脏，使用100目细胞筛网制备脾细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。将鼠脾淋巴细胞在刀豆球蛋白A（Con A）的刺激下体外培养72 h后，提取激活淋巴细胞总RNA；参照GenBank鼠IL-2 cDNA基因序列设计一对引物，逆转录得到cDNA，以此为模板进行PCR扩增。IL-2引物上游-ATATCTAGAATACAGCAGCATGCAGCTCGC-，下游-TCTGCTACCTTAGTCGTCGTGGTCTTTGTAGTCTTGAGG GCTTTTGAGATG-，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。

1.3.2 重组含有小鼠IL-2基因质粒载体 用XbaⅠ/KpnⅠ双酶分别酶切pFastBac Dual质粒和IL-2的PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳割胶回收DNA，分别作为载体和供体片段，通过T4连接酶连接得到pFB-IL-2，经过转化大肠杆菌JF1125得到pFB-IL2质粒，提取质粒进行酶切和PCR鉴定。

1.3.3 载体加入真核细胞启动子CMV 用EcoRⅠ酶切pFB-IL-2（需CIAP去磷酸化处理）和T-CMVp上切下CMV启动子片段，分别作为载体和供体片段，通过T4连接酶在16℃连接12 h,将CMV启动子插入pFB-IL-2的EcoRⅠ位点，经过转化大肠杆菌JF1125得到pFB-CMV-IL-2质粒，提取质粒DNA。

1.3.4 重组小鼠IL-2基因质粒载体的酶切鉴定和序列分析验证 pFB-CMV-IL-2质粒用KpnⅠ、XbaⅠ和BglⅡ分别进行酶切鉴定，结果正确后将构建的pFB-CMV-IL-2质粒转化JF1125，将菌液进行质粒序列分析测定（上海博尚生物公司）。

1.3.5 重组Bacmid-pFB-CMV-IL-2质粒转染Sf9细胞 利用Invitrogen公司的产品Bac-to-Bac系统来构建重组杆状病毒，挑取转化DH10Bac感受态细胞生长的白色菌落，提取Bacmid，脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9细胞包装病毒，Sf9细胞培养于FH10培养液中培养3 d，离心后收获上清，即获取完整重组杆状病毒，反复感染Sf9细胞扩增病毒。提取病毒基因组，用PCR验证重组杆状病毒的正确性。

1.3.6 重组杆状病毒转导BHK细胞 将24孔板中每孔接种大约1.5×105个BHK细胞，培养细胞过夜，贴壁后加入适量病毒液使感染复数（MOI）约为5 pfu/cell，37℃ CO2培养箱培养，病毒感染72 h后收获细胞。

1.3.7 SDS-PAGE电泳和Western blot检测重组的IL-2蛋白 用胰酶消化BHK细胞后，将细胞吹打下来，5 000 r/min离心5 min。弃上清，加入50 μL 2×SDS 样品缓冲液，100 ℃煮沸5 min。样品进行10%SDS-PAGE电泳，使用预染蛋白Marker，电泳后将PAGE胶剥离，放入NC膜转移装置中进行电转移，将电泳槽置于装满冰块盆中，恒流200 mA，电泳2 h；电转移结束后，取出转移NC膜，一抗用兔源F-7425 An⁃ti-Flag克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG抗体，在10 mL AP底物缓冲液中加入BCIP 33 μL、NBT 66 μL，将NC膜放入，进行显色反应，直到出现清晰的条带，膜干燥后，拍照后用塑料袋封存。

2 结果

2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 扩增产物片段大小为600 bp，与阳性对照IL-2吻合，见图1。

2.2 PCR鉴定pFB-IL-2质粒结果 扩增产物片段大小为600 bp，与阳性对照IL-2吻合，见图2。

2.3 酶切pFB-CMV-IL-2质粒结果 用KpnⅠ酶切PFB-CMV-IL-2分别得到0.5、0.7和4.7 kb共3个片段；用XbaⅠ酶切得到0.7和5.2 kb片段；用BglⅡ酶切得到0.5、1.8和3.6 kb共3个片段，与预期结果吻合，见图3。

2.4 测序结果 将菌液测序结果在NCBI进行检索，利用Blast软件在GenBank进行序列比对，与GenBank鼠IL-2相吻合，成功构建含鼠IL-2的载体质粒，测序验证实验结果正确。

2.5 重组杆状病毒穿梭载体的PCR验证 提取病毒DNA基因组，用IL-2特异性引物进行PCR扩增,成功扩出了1条约600 bp的条带，与预期结果相符，见图4。

2.6 Western blot结果分析 在50 ku之间有一条带,表明重组杆状病毒感染的BHK细胞表达了与抗单克隆抗体特异性结合的蛋白,即IL-2，见图5。

3 讨论

与其他病毒载体系统相比较，重组杆状病毒构建方便，而且易于扩大培养规模及得到高滴度的病毒；杆状病毒的基因组和棒状的核衣壳可以容纳100多kb的DNA，最大可插入约40 kb的外源基因；能转染末端分化细胞和原代培养细胞；以高感染复数感染哺乳动物细胞时也没有细胞毒性；安全性好，在哺乳动物细胞内不会整合到基因组中，不能复制，自身启动子在哺乳动物细胞内也没有活性。以上优点使得杆状病毒-昆虫细胞表达系统具有广泛应用性。自1983年Smith[3]首次利用AcNPV表达成功人干扰素-β以来，现估计有近千种外源基因在杆状病毒表达载体中得到表达。杆状病毒可以作为一种新型的基因表达载体将外源基因导入哺乳动物细胞内进行表达，因此，重组杆状病毒已被广泛应用于基因工程[4]、疫苗开发[5]、基因治疗[6]等众多领域中。

IL-2是主要由激活T淋巴细胞产生的一类Th1型细胞因子，它能够有效地提高机体的免疫功能，促进T、B淋巴细胞的增殖，增强NK细胞、单核巨噬细胞等的杀伤活性；能激活和提高免疫细胞的多种功能，提高其杀伤癌细胞、病毒或细菌感染细胞、促进抗体生成和分泌的能力，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及治疗感染性疾病中具有重要作用[7]。自Taniguchi等[8]从人体细胞中首次克隆出IL-2全长cDNA并报道其全序列以来，已从30多种动物中克隆出此基因，重组IL-2还在提高机体免疫力、抗感染和癌症治疗等方面获得了广泛的应用[9]。

本研究通过RT-PCR扩增出鼠IL-2基因，用Flag对IL-2进行标记，通过构建鼠IL-2的转移质粒，通过克隆将其插入pFastBacDual和pFastBacDu⁃alTAT，成功构建了杆状病毒表达系统的转移载体pFB-CMV-IL2质粒，通过转染Sf9昆虫细胞，获得含IL-2的重组杆状病毒，通过转导BHK细胞成功表达IL-2蛋白，为进一步研究该重组蛋白的生物学活性、动物实验等奠定了良好的基础，亦为其他蛋白质的真核表达提供了方法学的参考。

致谢：感谢复旦大学微生物系钟江教授提供资助。

[1]Onishi H,Maeda K,Maeda Y,et al.Functional Chicken Gizzard Heavy Meromyosin Expression in and Purification from Baculovi⁃rus-Infected Insect Cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995,92（3）:704-708.

[2]Cha K,Bruel C,Inglese J,et al.Rhodopsin kinase Expression in bac⁃ulovirus-infected insect cells,and characterization of post-transla⁃tional modifications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997,94（5）:10577-10582.

[3]Smith MD.Production of human beta interferon in insect cell infect⁃ed with baculovirus express vectors[J].Mol Cell Biol，1983,3（2）:2156-2165.

[4]Ames RS,Formwald JA,Nuthulaganti P,et al.BacMam recombinant baculoviruses in G protein-coupled receptor drug discovery[J].Re⁃ceptors Channels,2004,10（3）:99-107.

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[8]Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2[J].Nature,1983,302（5906）:305-310.

[9]Zelus D,Robinson RM,Delacre M,et al.Fast evolution of interleu⁃kin-2 in mammals and positive in ruminants[J].J Mol Evol,2000,51（3）:234-244.

Bac-to-Bac Baculovirus Expression System in IL-2 Protein of BHK

HUANG Dalin,DAI Zhikai,WANG Xin,LI Binbin,ZHONG Jiang

Guilin Medical University,Guangxi 541004,China

Objective：To construct recombinant mouse IL-2 protein in BHK cells using Bac-to-Bac baculovirus expres⁃sion system.Methods：The mouse IL-2 was marked by Flag，and joined the eukaryotic cell promoter CMV.The plasmid pFB-CMV-IL-2 was constructed to recombinant,restriction enzyme was used to digest,and was amplified by PCR.The mouse IL-2 was cloned into the baculovirus expression vector pFastBacDual and pFB-CMV-IL-2 was transformed into bacu⁃lovirus shuttle vector containing the DH10Bac competent bacmid bacteria.The clones were recombinant baculovirus vector Bacmid-pFB-CMV-IL-2,extracted plasmid with liposome transfection method Bacmid-pFB-CMV-IL-2 transfected Sf9 in⁃sect cells packaging the virus,harvested recombinant baculovirus.A virus transduction of BHK cell culture was built using Western blot to detect the IL-2 protein.Results:By baculovirus expression system,mouse recombinant IL-2 protein was successfully expressed in BHK cells.Conclusion:Recombinant baculovirus was successfully expressed mouse IL-2 protein in eukaryotic cells.

interleukin-2 recombinant proteins baculoviridae genetic vectors plasmids polymerase chain re⁃action mice,inbred strains

*国家科技攻关863资助项目（项目编号:2007AA02Z125）

541004 广西，桂林医学院微生物学与免疫学教研室（黄大林，戴支凯）；复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系（王鑫，李彬彬，钟江）

△通讯作者 E-mail:jzhong@fudan.edu.cn

（2010-09-08收稿 2010-11-29修回）

（本文编辑 魏杰）