高效毛细管电泳测定液态乳中乳糖

钟宁，侯彩云

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

高效毛细管电泳测定液态乳中乳糖

钟宁，侯彩云

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

针对常用乳糖测定方法存在的局限性和不便性，结合高效毛细管电泳（HPCE）法简单快速、高效低耗的特点，探索出了高效毛细管电泳仪配合紫外检测器测定乳糖的实验条件：熔融石英毛细管（50 μm×34 cm）；缓冲液为50 mmol/L硼砂/NaOH，pH值为10.0；电泳为10 kV，温度为60℃；检测波长为195 nm；进样为5000 Pa；时间3 s。此方法操作简便、准确度高、精密度好。该方法的测定结果与高效液相色谱法的结果较一致，样品中其他糖类对该方法不存在干扰，克服了莱因-埃农氏法测定乳糖不具专一性的缺点。

液态乳；乳糖；高效毛细管电泳

0 引 言

乳糖是牛乳中的固有成分，通常多于其他固形物组分，浓度相当稳定[1]。在乳品工业中，乳糖的检测也是原料乳验收和成品检验中的重要项目。目前乳糖测定方法主要有高效液相色谱法[2-5]、直接滴定法[2,6]、直接比色法[7，8]、近红外光谱法[9，10]、旋光法[11]、毛细管电泳法[12-14]等。我国现行的关于乳糖检测的标准中推荐高效液相色谱法和莱因-埃农氏法[2]，但莱因-埃农氏法存在滴定条件不易控制和终点难以确定的缺点，而高效液相色谱法（配合示差折光检测器）的稳定性、重复性和选择性均有一定程度的不足。

近年发展起来的高效毛细管电泳法（HPCE）具有简单快速、高效和低耗的特点[15]。本文探索了高效毛细管电泳法配合紫外检测器测定乳糖的实验条件，并评估了该方法的精密度和准确度。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效毛细管电泳仪（HP3DG1601BA），空心石英毛细管（50 μm I.D/365 μm O），高效液相色谱仪（泵：HPLC K-501;检测器：K-2301示差折光检测器），超声波清洗器，精密pH计（PHS-3C），高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ型），电子天平（FA2004）。

1.1.2 试剂

乳糖（10，20，30，50，70 g/L）、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖（以上糖类均为20 mg/mL）、0.5 M氢氧化钠溶液、硼砂溶液（浓度为40，50，60，70，80，90 mmol/L）、饱和氢氧化钠溶液（20℃）、质量浓度为100 g/L三氯乙酸溶液（TCA）；乙酸锌溶液（21.9 g乙酸锌+3 mL冰乙酸，纯水定容至100 mL）、106 g/L亚铁氰化钾溶液；费林氏液[2]、次甲基蓝溶液（10 g/L）、乙酸铅溶液（200 g/L）、草酸钾-磷酸氢二钠溶液[2]。

以上均为国产分析纯试剂，实验用水均为纯水。

10种市售液态乳样品：样品1～10，其中样品1～5为纯牛奶，样品6和7为低乳糖奶（乳糖水解率≥90%），样品8～10为高端奶。

1.2 方法

1.2.1 毛细管电泳

（1）样品预处理。取40 mL样品，加入TCA溶液定容至100 mL，3000 r/min离心5 min后过滤[16]。取50 mL滤液加0.9534 g硼砂并溶解，然后用饱和NaOH溶液调至pH值为10.0，再次用滤纸过滤此溶液并用0.45 μm水系微孔滤膜过滤，转入样品瓶。进样前超声处理去除气泡。

（2）高效毛细管电泳条件。电泳条件：毛细管为50 μm×34 cm；缓冲液为浓度50 mmol/L硼砂/NaOH，pH值为10.0；工作电压及温度为10 kV和60℃；检测波长为195 nm；压力进样5 000 Pa（3 s）。

新毛细管在用于电泳分析前先用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液冲洗30 min，再依次用纯水和缓冲液各冲洗10 min。两次进样之间，毛细管用浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液冲洗3 min，再依次用纯水和缓冲液各冲洗1 min[15]。

（3）标准曲线的制作。配制质量浓度为10，20，30，50，70 g/L乳糖溶液，按上述（2）中电泳条件分别进样。

1.2.2 高效液相色谱

（1）样品预处理。称取液态乳10 g（精确至0.1 mg），于150 mL带有磁力搅拌子的烧杯中，加水约50 g溶解，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，加水至溶液总质量为100 g（精确至0.1 mg），磁力搅拌30 min，放至室温后，用干燥滤纸过滤取约2 mL滤液过0.45 μm微孔滤膜。

（2）高效液相色谱条件。色谱柱为Shodex SPO 810 Pb2+柱；柱温为80℃；流动相为水；流速为1 mL/min。

1.2.3 莱因-埃农氏法

按GB5413.5-2010中规定的方法[2]。

2 结果和分析

2.1 电泳实验条件的确定

实验证明，温度能够明显地影响乳糖的出峰时间。实验用质量浓度为20 g/L乳糖溶液进样，保持其他电泳条件不变，仅调节电泳温度分别为20，30，40，50，60℃，结果当电泳温度为60℃时，出峰时间最短（图1）。

图1中，毛细管为50 μm×34 cm；缓冲液浓度为50 mmol/L硼砂/NaOH（pH值为10.0）；电泳电压为10 kV（20～60℃）； 检测波长为195 nm； 进样为5 000 Pa（3 s）；1为系统峰，2为乳糖。 下同。

2.1.2 缓冲液硼砂浓度的选择

缓冲液中硼砂的浓度对乳糖的出峰时间及峰面积大小也存在明显的影响。仍用质量浓度20 g/L乳糖溶液进样，保持其他电泳条件不变，仅把缓冲液的硼砂浓度分别设为40，50，60，70，80，90 mmol/L，电泳结果显示50 mmol/L的硼砂缓冲液中乳糖的出峰时间最短且峰形好（图2）。

图2中，缓冲液浓度为40～90 mmol/L硼砂/NaOH，温度为60℃（下同）。

2.1.3 缓冲液pH值的选择

本研究中，乳糖的羟基在高pH值溶液中发生电离，从而与硼酸根离子复合形成可被紫外检测器检出的复合物， 因此配制pH值为10，11，12，13的硼砂/NaOH缓冲液，进样仍为质量浓度20 g/L乳糖，其他条件不变，实验结果显示，pH值也会影响乳糖的峰形和出峰时间，如图3所示。由图3可以看出，pH值为10.0时峰形好且出峰快。

（3）金相检验 在原材料上取金相试样，使用德国徕卡DMI5000M智能显微镜进行显微观察，检验结果如表3所示，由表3可知，原材料除显微组织出现微量的Fe3C外，其他检验结果均符合GB/T24238—2009标准技术要求。

因此，选取最佳HPCE分析条件：毛细管为50 μm×34 cm；缓冲液浓度为50 mmol/L硼砂/NaOH；pH值为10.0；电泳电压为10 kV（60℃）；检测波长为195 nm；进样为5 000 Pa（3 s）。

2.2 标准曲线

作乳糖质量浓度-峰面积的标准曲线（图4），得到标准曲线的回归方程y=7.9397x+3.9293，R2=0.9999。此方法中，乳糖质量浓度与峰面积线性相关性很好。

2.3 HPCE方法的评价

2.3.1 HPCE方法的精密度

按1.2.1中方法对样品1重复测定8次，根据出峰时间及峰面积，计算变异系数以分析精密度（表1）。

表1 精密度实验结果

本方法测定乳糖的出峰时间、峰面积和乳糖浓度的变异系数分别为1.1%、1.7%和1.7%，均小于5%，可以判定，本方法具有良好的重复性。

2.3.2 HPCE方法的准确度

分析结果的准确度由回收率判定，做添加50%、100%、150%乳糖的加标回收率试验。取20 mL样品，按实验需要加入一定量的乳糖（表2），然后按1.2.1（1）中步骤预处理，进样、分析条件不变。

本方法的加标回收率在50%和100%水平较好，准确度高，150%水平的加标回收率偏高。

2.4 HPCE分析乳糖的结果

实验样品牛乳中乳糖的HPCE图谱可分为两类，高乳糖型（图5）和低乳糖型（图6）。

表2 加标回收率实验结果（n=5）

高乳糖型的谱图是由纯牛奶（样品1～5）和高端奶（样品8～10）进样所得，低乳糖型谱图则由低乳糖奶（样品6和7）进样得到的结果。可见，用HPCE分析牛乳中的乳糖具有专一性，即牛乳中存在的其他糖类对乳糖的分析不存在干扰。

2.5 HPCE与现有方法的比较

HPCE法与HPLC法和莱因埃农氏法测定牛奶中乳糖的结果比较如图7所示。

可以看出，3种方法在测定样品1～5（普通奶）及样品8～10（高端奶）时结果一致，但HPCE法的测定结果普遍偏高。测定样品6和7（低乳糖奶）的结果中，HPCE和HPLC结果较一致，莱因-埃农氏法则结果过高，原因是莱因-埃农氏法是以测定还原糖的菲林实验为原理，实际测定的是样品中的还原糖，而非专一测定乳糖，样品中如添加其他还原糖，就会对实验结果造成干扰。

3 讨 论

鉴于现有乳糖测定方法在实际应用中存在的局限及不便性，结合近年发展起来的高效毛细管电泳简单快速、高效和低耗的特点，探索出HPCE法用于测定牛奶中乳糖的实验条件。实验中用三氯乙酸去除牛奶中的蛋白质，调样品溶液pH至10.0并使样品溶液中的硼砂浓度为50 mmol/L。HPCE的分析条件如下：毛细管：50 μm×34 cm； 缓冲液：50 mmol/L硼砂/NaOH（pH值为10.0）；电泳电压为10 kV（60℃）；检测波长为195 nm；进样：5000 Pa（3 s）。 对HPCE法做精密度和回收率实验，显示该方法有良好的精密度和准确度。

实验结果的谱图均存在明显的系统峰，如何消除系统峰还需进一步的实验探索。并且发现在两种样品类型的谱图中，乳糖出峰后都出现了其他峰，其具体为何种物质，也有待进一步分析测定。

[1]郭本恒.乳品化学[M].北京：中国轻工业出版社,2001：312.

[2]中华人民共和国卫生部.GB 5413.5-2010婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定[S].

[3]吴莉,周红.应用氨基柱测定奶粉中的糖份[J].武汉化工学院学报,2002,24（2）：4-5,8.

[4]WANG X M,ZHANG R L.Determination of Glucosamine and Lactose in Milk-based Formulae by High-performance Liquid Chromatography[J].Journal of Food Composition and Analysis，2008,21：255-258.

[5]FERREIRA I M P L V O,GOMES A M P.Determination of Sugars,and Some Other Compounds in Infant Formulae,Follow-up Milks and Human Milk by HPLC-UV/RI[J].Carbohydrate Polymers，1998,37：225-229.

[6]张鸿军.乳制品中乳糖检验方法的探讨[J].食品科学,2000,21（12）：115-116.

[7]朱坚.SN/T 0871-2000进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法[S].北京：中国标准出版社,2000.

[8]樊宏,陈强.乳制品中乳糖直接比色测定方法探讨[J].中国卫生检验杂志,2006,16（3）：296-297.

[9]王丽杰,徐可欣.采用近红外光谱技术检测牛奶中脂肪、蛋白质及乳糖含量[J].光电子·激光,2004,15（4）：468-471.

[10]李庆波,汪曣.牛奶主要成分含量近红外光谱快速测量法[J].食品科学,2002,23（6）：121-124.

[11]张忠义,刘振林.牛奶中乳糖的快速旋光仪测定[J].中国卫生检验杂志,2001,11（4）：434-435.

[12]ZHANG X,CAO Y H.Determination of Lactose in Sugar-free Milk Powder by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection[J].Food Chemistry，2001,72：385-388.

[13]马晓丽,孟磊.大蒜多糖中单糖组分的毛细管电泳研究[J].时珍国医国药,2010,21（5）：1259-1260.

[14]张欣,丁祥欢.乳糖和麦芽糖水解反应速率常数的毛细管电泳测定方法[J].分析测试学报,2001,20（1）：16-18.

[15]ALTRIA K,ENNIS K,SADLER R.Quantitative and Selective Analysis of Lactose by Capillary Electrophoresis[J].Chromatographia,1999,49：406-410.

[16]丁晓静,杨媛媛.原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶中蛋白去除效果的研究[J].分析化学研究报告,2010,38（1）：77-81.

Determination of lactose in milk by high-performance capillary electrophoresis

ZHONG Ning,HOU Cai-yun
（College of Food Science and Nutrition Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

The disadvantage of present usual methods of determination of lactose is their limitations or inconveniences.In this paper,the optimal experimental conditions of determination of lactose in milk by high-performance capillary electrophoresis（HPCE,Agilent,HP3DG1601BA）with UV detector were explored：fused silica capillary（50 μm ID×34 cm）,buffer solution：50 mM borate/NaOH,pH 10.0,HPCE conditions：10 kV,60℃,UV detection at 195 nm,sample was injected at 5 000 Pa for 3 s.This method is easy to operate and has good accuracy and precision.The result of this method is consistent with high-performance liquid chromatography（HPLC）method when they detect the lactose in milk,and other reducing sugars in milk will not interference the result of HPCE method.

milk;lactose;high-performance capillary electrophoresis

TS252.7,TS245.6

A

1001-2230（2011）10-0044-04

2011-07-12

钟宁（1988-），女，硕士，从事食品质量与安全方面的研究。

侯彩云