乳酸菌基因组学与干酪风味的关系

陈琦，马燕芬，王利

（1.内蒙古医学院分子生物学研究中心，呼和浩特 010059；2.内蒙古农牧业科学院动物营养所，呼和浩特 010030）

乳酸菌基因组学与干酪风味的关系

陈琦1，马燕芬2，王利1

（1.内蒙古医学院分子生物学研究中心，呼和浩特 010059；2.内蒙古农牧业科学院动物营养所，呼和浩特 010030）

介绍了乳酸菌的基因组学、乳酸菌与干酪风味之间的关系以及干酪的成熟机制。乳酸菌基因组学研究有助于揭示乳酸菌的遗传和代谢机制，挖掘重要益生功能基因，为乳酸菌的在干酪生产中的应用提供基础。

乳酸菌；基因组学；干酪；风味

0 引 言

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类能够通过同型发酵或异型发酵而产生乳酸的细菌[1]。根据发酵形式不同，乳酸菌可以分为两类：同型发酵菌主要产物为乳酸，而异型发酵菌除乳酸还同时产生乙酸、乙醇、二氧化碳及甲酸等[2]。乳酸菌具有加速食品酸化、产生风味物质、增加食物营养并改善食品质地等功能。实验证明，使用特色的发酵剂，更有利于大量生产均质、高质量的干酪。干酪工业的发展前景和经济活力依赖于一些已知、可以预测并具有特色的发酵剂，因此为了挖掘乳酸菌的潜力，研究者致力于乳酸菌基因组学研究，期待从分子水平揭示乳酸菌的多样性，阐明乳酸菌的生理及代谢机制，挖掘控制重要性状的功能基因，提高发酵食品的工业化控制水平，为高效利用乳酸菌提供依据[3]。

1 乳酸菌的基因组学

1.1 与干酪相关的基本特征

根据伯杰细菌鉴定手册，乳酸菌目前主要分为23个属，主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lacto-coccus）、明串珠菌属/白联球菌属（Leuconoszo）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptoeoccus）、肠球菌属（Enleroccu）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和肉食菌属（Caroobaelerium）等[4]。LAB新陈代谢的主要终产物是乳酸，其中乳杆菌、乳球菌、名串珠菌和链球菌是重要的工业菌。

乳酸菌广泛分布于自然界中，主要特性为低鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量（＜55%）、强耐酸性、不产生孢子、营养要求高、耐氧但不需氧、不能合成卟啉。乳酸菌基因组的大小在1.8～3.2 Mb之间，基因数量和可以预测的蛋白质数量相差较大，干酪乳杆菌ATCC334的基因组相对比较大，为3.35 Mb，以上这些差异表明乳酸菌正处于一个动态的进化过程中[5]。大多数乳酸菌基因组G+C含量都在50%以下，唾液乳杆菌UCC118的G+C含量最低，只有33%，而双歧杆菌的G+C含量高达60.1%。尽管LAB各个菌属RNA结构基因数量各异，但都含有rRNA操纵子和tRNA编码基因，某些LAB还含有质粒与噬菌体编码基因，其中rRNA操纵子和tRNA编码基因属于基本功能基因，质粒与噬菌体编码基因属于特殊功能基因。

LAB各个菌属的rRNA操纵子数量变化较大，其中乳杆菌属的rRNA操纵子数量较多。rRNA操纵子排列具有一定顺序性，通常为16s rRNA，23s rRNA，5s rRNA，而且在它们周围常常会出现tRNA Ile，tRNAAla，tRNALys等编码基因。tRNA编码基因数量为43～98个，同样乳杆菌属偏多。

有些乳酸菌，特别是乳球菌，菌体细胞内含有多种质粒，大小从1.9～242 kb不等[6]。许多与工业化生产相关的性状都是由这些质粒编码的，如乳糖代谢酶类、摄取柠檬酸盐的酶、蛋白水解酶类、细菌素的生成、噬菌体抗性、多糖的合成等[7]。明串珠菌ATCC8293和部分乳杆菌细胞中含有质粒，德式乳杆菌和大多数嗜热链球菌细胞中则没有质粒，乳酸乳球菌SK11细胞中包括5个不同种类的质粒。此外，还有一些乳酸菌具有复杂的插入重复序列（IS），说明这些LAB有较高的遗传可塑性[8]。某些LAB中还含有噬菌体编码基因，但数量通常都很少，仅仅为1-2个。乳酸乳球菌乳脂亚种MG 1363中的噬菌体编码基因都携带有tRNA编码基因，还含有一个噬菌体矫正序列，其中包括一个长度为712个氨基的插入序列。

1.2 与干酪相关的研究进展

早期对乳酸菌的研究工作大多集中于菌种的分类和菌株的筛选以及构建动物模型对部分益生特性进行验证等方面的研究。随着分子生物学理论及生物技术的发展，人们开始利用分子生物学方法对乳酸菌的分类、基因功能及其代谢途径进行研究。LAB中与细胞分解代谢及合成活动相关的所有管家基因都定位在染色体上，因此了解LAB染色体结构和组成对于了解细胞分解代谢和合成具有重要意义。研究发现特定基因的微小变化或突变都会导致蛋白质发生变化，进而使奶酪的品质发生极大的变化。

自Sorokin等（2001）完成第一株乳酸菌——乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis ssp.lactis）IL1403的全基因组测序以来，掀起了乳酸菌全基因组测序的浪潮。美国成立了乳酸菌基因组协会 （LAB Genomics Consortium，LABGC），对多种乳酸菌进行全基因组测序。迄今为止，已经发表的乳酸菌基因组达22株，绝大多数是由美国和欧洲等发达国家的实验室完成的。表1列出了已完整公布全基因组序列的乳酸菌和几个工业上比较重要的LAB菌种的基因组序列信息，14个菌种的基因组信息是公开的，其中10个是由美国的乳酸菌基因组联盟（LABGC）研究的结果。

对乳酸菌基因组学的深入研究有利于其在乳品发酵方面应用，例如：筛选具有特定胞外多糖特性及数量的嗜热链球菌；分析乳酸菌的基因组可以将其的基因特点和益生功能联系起来在分子水平上筛选具有特定功效的菌株；进一步探索噬菌体的分子进化规律，阐明乳酸菌噬菌体的机制。

嗜酸乳杆菌NCFM是全球第一个完成基因序列的商业菌株。通过对该菌株的全基因序列分析，可以将其基因序列的某些片段与菌株的生物化学，生理特性及功能，加工与储存特性（如菌株的发酵条件，储存过程的稳定性，冻干条件）相联系。

表1 与乳制品有关的乳酸菌和其他菌种的基因组序列

嗜热链球菌是工业化应用中最重要的乳酸菌之一，广泛地用于多种奶酪和酸奶的生产，近年来对嗜热链球菌噬菌体的广泛和深入研究也成为热点。目前，已经公开发表的嗜热链球菌噬菌体的完整基因序列有7种，包括cos-类噬菌体DT1,Sfi19,Sfi21,7201及pac-类噬菌体O1205,Sfi11和2972。

鼠李糖乳杆菌Howaru Rhamnosus也是目前研究较多的、保健功效较强的益生菌。研究证明其具有调整肠道菌群，抑制肠道有害菌，激活免疫功能等功效。测序研究发现其已知基因900多个，其中300多个和益生菌功能有关。该菌株能够合成除色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸之外的全部氨基酸，还可以合成叶酸、亚铁原卟啉、维生素B1等生长因子。

2 乳酸菌基因组学与干酪风味

干酪风味是由干酪中的挥发性风味物质和芳香性风味物质组成的混合物，主要包括原料乳中的风味化合物及成熟过程中酶和微生物作用于基质产生的风味化合物。具有风味活性的物质多数是有机物，包括酸、醇、酯、内酯、酮、酚、醛、醚等。

虽然早在100年前就已经发现LAB和干酪风味之间的关系，但由于微生物学、酶学和干酪微环境的复杂性，早期很难定义LAB是如何影响干酪风味的。直到20世纪50年代后期，英国食品研究学院的Elisabeth Sharpe等发明了无菌加工干酪技术，进而证明LAB是产生干酪风味所必需的。

许多微生物对干酪风味的形成是至关重要的。干酪微生物主要分为两大类：发酵微生物和次级微生物。发酵微生物在干酪的制作过程中主要起着产酸和促进凝乳的作用。主要的发酵微生物是乳酸菌（LAB），不同种类的LAB也可能影响干酪风味，这个领域的研究主要集中在乳酸球菌属，它是切达干酪，高达干酪及许多其它干酪和与牛奶有关的乳酸菌品种的发酵剂。由于工业化方面的应用，已经对乳酸乳球菌代谢机制、遗传、分子生物学和生理方面进行了广泛深入的研究，并已成为乳酸菌研究的模式菌[4]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）主要用作干酪的发酵剂，分为乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis ssp.cremoris）和乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis ssp.lactis），前者适用制作硬质奶酪，后者适用制作软质奶酪。次级微生物在干酪的制作过程中不能产酸，但在成熟过程中对风味形成有着很重要的作用。非发酵剂乳酸菌（NSLAB）是其中主要的次生菌群。

干酪在成熟开始时，发酵剂的数目通常每克干酪超过109CFU（见图1），但是干酪成熟对微环境的要求很严格，比如残留乳糖、高浓度的NaCl，低pH值和低温都会影响发酵剂的成活率，大部分发酵剂自我分解，导致成熟细胞内的酶和其他细胞组分释放到干酪组中，进而影响成熟过程。起初NSLAB菌群的数目一般在102CFU/g以下，然后开始生长，在成熟的3～9个月后细胞密度最终稳定在107CFU/g～109CFU/g（见图1）。

3 干酪成熟机制

干酪成熟过程主要包括乳糖代谢、蛋白质水解和脂肪分解三大生化反应。在发酵剂的作用下，乳糖经糖酵解途径或异戊二糖途径产生乳酸；蛋白质在干酪中残留的凝乳酶、乳内源性酶和微生物酶的作用下水解成肽和氨基酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醇类、醛类等一系列化合物。

乳糖酵解后产生乳酸，产生乳酸的多少直接影响干酪的质量，因为在培养过程中，乳酸决定最终的pH值及凝乳中的矿物质含量，同时影响蛋白质结构和凝乳中残留的促凝剂的数量，进而最终影响干酪的质地和风味。乳酸盐本身也是形成干酪风味的成分，并将其转化为丙酸和二氧化碳；丙酸也是形成干酪风味的重要成分，而二氧化碳则可以使干酪出现蜂窝眼。若发酵剂迅速耗尽凝乳中残留的糖，这样就可以避免产生异味的外来细菌利用凝乳中残留的糖作底物（例如异发酵乳酸短杆菌），进而避免导致干酪品质下降。

蛋白质水解是干酪成熟过程中发生的3个基本生化反应中最重要而且最复杂的一个途径。主要包括以下两步：一是蛋白质降解（蛋白质水解、肽水解），二是游离氨基酸降解为风味物质，其中第二步是风味形成的关键。

蛋白质水解是多种酶参与的反应，包括凝乳酶、自身的胞浆素、来源于发酵剂和非发酵剂乳酸菌的微生物蛋白酶与肽酶。发酵剂将牛乳中的酪蛋白降解成能被细胞吸收的肽类和游离氨基酸[9]。酪蛋白的水解是由添加的凝乳剂催化，而LAB蛋白酶和肽酶主要生成水溶缩氨酸和自由氨基酸。在这个反应中产生的一些低分子量的苦味肽会直接影响干酪风味。释放的游离氨基酸也会影响干酪风味，它们是产生干酪主要风味物质的前体。例如，谷氨酸盐和天冬氨酸残基可以增加风味。LAB作为初发酵剂在很多种干酪中得到应用，揭示这些微生物的蛋白水解体系是干酪成熟中的关键步骤。

氨基酸的分解代谢产生很多种物质，主要包括氨、胺、乙醛、苯酚、吲哚和乙醇，这些物质整体上有助于干酪风味的形成。实验证明：LAB将自由氨基酸转化为芳香氨基酸是干酪风味产生的关键步骤。氨基酸分解作用的产物会形成风味，这些分解作用包括脱羧、脱氨、转氨、脱硫和侧链水解。研究LAB分解代谢氨基酸都是针对芳香族、枝链及含硫氨基酸的降解物，因为它们在气味中起关键作用。例如，蛋氨酸转化为含硫挥发性化合物，这使得许多干酪制品含有特殊的风味。

脂肪酶或酯酶作用于奶脂肪产生的脂肪酸也直接影响干酪的风味，并且作为酯和其他风味成分的前体进一步发挥作用。而且酯酶和脂肪酶催化酯的水解与合成，主要取决于干酪中水的活性和其他可利用的脂肪酸及乙醇的水平。这些酶可能来自凝乳酶浆、牛奶本身及发酵剂和非发酵剂中的LAB。例如，反刍动物乳中的脂肪酶和酯酶能产生某些意大利干酪所特有的气味。但是，用脱脂乳制成的硬质意大利干酪中，没有使用脂肪酸酶和酯酶，与脂类分解作用有关的风味可能是由于本土的牛奶中的酶和微生物酶的作用。大多数LAB缺乏分解脂肪的活性，但是如果干酪成熟时间长，这些细菌可以生成足够的自由脂肪酸和酯，从而影响风味。

最后，LAB利用柠檬酸盐产生琥珀酸盐或联乙醯。琥珀酸盐是一种类似谷氨酸钠物质，可提高干酪中的风味，可以从几种干酪中分离。从感官评价的研究结果表明琥珀酸盐使得瑞士干酪风味易于被大众接受，同时也使切达干酪产生特有的风味。瑞士干酪和其他干酪中，费氏丙酸杆菌亚种、丙酸杆菌的数目很多，琥珀酸产物主要参与丙酸菌中的天冬氨酸代谢。但是，在切达干酪和其他干酪中，NSLAB通过还原性三羧酸循环将柠檬酸盐转化为琥珀酸盐。

另一个重要的源自柠檬酸的风味成分——联乙醯，它在黄油、酪乳和一些干酪制品中的重要性已经得到公认。联乙醯由-乙酰乳酸氧化分解形成，-乙酰乳酸是丙酮酸盐代谢和氨基酸生物合成的中介。近几年，对柠檬酸盐代谢和联乙醯产物的深入研究，使得可以有效控制乳球菌以提高联乙醯产量。

4 结束语

综上所述，乳酸菌基因组学的研究可以拓宽对乳酸菌的认识，从微观角度理解乳酸菌及其功能基因，揭示乳酸菌的遗传和代谢机制，为阐明LAB影响干酪风味的基础机制奠定基础，这将有利于乳制品企业在生产过程中提高干酪风味。随着乳酸菌基因组学一级相关交叉学科（如生物信息学和计算机学等）的进一步发展，将极大的推进乳酸菌应用于干酪生产以提高干酪的风味。

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Relationship between Lactic Acid Bacteria genomics and cheese flavor

CHEN Qi1，MA Yan-fen2，WANG Li1
（1 Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010059，China;2 Animal Nutrition Institute,Inner Mongolia Academy of Animal Science，Huhhot 010030，China）

This paper has reviewed the genomics of LAB,the relationship between LAB and cheese flavor and the mechanism of Cheese Ripening.These studies will contribute to reveal the genetic and metabolic mechanisms of Lactic Acid Bacteria,promote the finding of important functional genes,and provide the basis for applying LAB into cheese production.

Lactic Acid Bacteria；Genomics；cheese；flavor

Q966,TS252.53

B

1001-2230（2011）10-0040-04

2011-07-21

内蒙古医学院博士启动金（nybq2010cq）。

陈琦（1980-），女，副研究员，研究方向为分子生物学与基因组学。