脑乳酸在运动性疲劳过程中作用机制的动态研究

杨东升，刘晓莉，乔德才

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脑乳酸在运动性疲劳过程中作用机制的动态研究

杨东升1，2，刘晓莉2，乔德才2

目的：研究脑乳酸在运动性疲劳发生过程中的作用机制。方法：采用微透析活体检测技术，观察力竭运动过程中大鼠纹状体乳酸浓度的动态变化，通过脑室注射乳酸阻断剂（4-CIN），观察脑内乳酸干预对大鼠运动耐力及皮层脑电（ECoG）的影响。结果：大鼠纹状体胞外乳酸浓度在运动初期显著升高（P＜0.05），在运动后期直至疲劳后的恢复期均显著低于安静时水平（P＜0.05，P＜0.01）；运动过程中，大鼠4-CIN脑室注射后20 min皮层脑电功率谱总功率迅速下降，显著低于人工脑脊液（aCSF）对照组（P＜0.05），脑乳酸阻断组大鼠运动至力竭平均时间显著低于对照组（P＜0.01）。结论：脑乳酸在运动性疲劳的发生过程中发挥着重要作用，脑乳酸代谢不足可能是导致运动性疲劳出现，机体运动能力降低的主要原因之一。

乳酸；脑；大鼠；皮层脑电；运动疲劳

Pellerin等1994年提出的“星形胶质细胞－神经元乳酸穿梭”假说为脑乳酸赋予了新的代谢角色，乳酸不再是脑内能量代谢的“废物”和缺血缺氧的“毒物”，而是能量代谢不可或缺的代谢底物[1]。进一步的研究证明，脑内神经元还具有优先利用乳酸作为其能量代谢底物的特性[2]。有研究发现，运动过程中，脑对于葡萄糖的摄取会随着运动强度的增加而减少，同时，脑利用乳酸作为其能量代谢底物以维持运动所需的神经元的活动[3]。神经系统不能产生和维持足够的神经冲动到达所支配的运动肌是导致运动性疲劳的主要原因[4]。脑内能量代谢是神经系统电生理活动的物质基础，脑乳酸在维持神经元的活性方面均起着非常重要的作用[5-6]。因此，机体运动过程中脑乳酸的代谢平衡是保证中枢神经系统持续向外周发放神经冲动、维持运动能力的关键因素。

长期以来，受传统研究手段和方法的局限，对于运动过程中脑乳酸的研究无法实现，现有相关的少量报道也多是对于运动疲劳后机制的探讨，无法解释乳酸在运动疲劳形成过程中的作用。因此，本文采用微透析与电化学检测联用的技术对大鼠在一次力竭运动过程中及力竭后恢复期脑乳酸的代谢变化进行在线观察。乳酸阻断剂（alpha-cyano-4-hydroxycinnamate，4-CIN）可以有效的阻止神经元对乳酸的摄取和利用[7]，因此本文同时采用脑室微量注射乳酸阻断剂的研究方法，观察脑乳酸干预对大鼠运动耐力及其皮层脑电（electrocorticogram，ECoG）的影响，为进一步揭示脑乳酸代谢与运动性疲劳的关系提供实验依据。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象

健康雄性Wistar大鼠随机分为脑乳酸测定组、4-CIN干预组和对照组，实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2005-0002，体重（250±10）g，常规分笼饲养，室内温度（20±3）℃，相对湿度40%～60%，自然光照。

1.2 实验仪器及试剂

BAS微透析系统，三维脑立体定位仪，乳酸在线电化学分析系统，动物跑台，多导电信号采集处理系统，皮层电极及导联装置（自制）；戊巴比妥钠（Fluka），alpha-cyano-4-hydroxycinnamate（sigma）。人工脑脊液（Artificial cerebrospinal fluid，aCSF）各组份浓度（mmol/L）分别为：NaCl 126，KCl 2．4，KH2PO40．5，MgCl20．85，NaHCO327．5，Na2SO40．5，CaCl21．1，pH值为7．4，无菌（0．2uM）过滤，冷藏备用。

1.3 大鼠微透析探针套管的植入手术

脑乳酸测定组大鼠以戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉，固定于脑立体定位仪上，分离头顶皮肤，按照大鼠脑立体定位图谱[8]，纹状体对应部位钻孔，掀去硬脑膜，将微透析套管定位于左侧纹状体内（P：0．2，L：3，H：3．2），小螺钉、牙科水泥固定。术后恢复4到5天，待大鼠恢复正常的行动与饮食，无萎靡不振等不良术后反应，开始恢复性的渐增负荷跑台运动训练。

1.4 大鼠脑室注射管、ECoG电极的植入手术

乳酸干预组和对照组大鼠麻醉固定后，在侧脑室对应的颅骨部位钻孔（P：0．9 mm，R：1．5mm，H：3．5mm），掀去硬脑膜，植入微量注射导管。在脑皮层上下肢运动区对应的颅骨部位钻孔，将皮层记录电极植入脑皮层表面（P：1．8mm，R：2 mm，H：0．5 mm），小脑上方（P：10．0 mm，R：0 mm，H：0．5 mm）放置参考电极，牙科水泥固定，术后处理同乳酸测定组。

1.5 大鼠力竭运动方案

当术后大鼠能够以20m/min的速度跑30min后，即可进行正式实验。运动方案参照Bedford运动方案[9]稍作调整：运动负荷分为三级：I级负荷：10 m/min，15 m in；II级负荷：15 m/min 15min；III级负荷：20m/m in，至力竭。在实验过程中观察大鼠的运动行为特征，判断动物的疲劳状态。大鼠力竭标准为大鼠跑姿由蹬地跑变为伏地跑，长期滞留于跑道末端，声、光刺激均不能使其继续跑动。

1.6 力竭运动过程中及恢复期大鼠脑乳酸的实时监测

将微透析探针插入脑乳酸测定组大鼠的探针套管内，探针连接灌流系统，人工脑脊液灌流，速度为1μL/min，灌流平衡时间为60min，然后将透析液与电化学检测系统连接，开始大鼠在一次性力竭运动过程及恢复期脑乳酸的动态在线监测。电化学检测采用林雨清等人所建立的方法[10]，采样频率为2次/s。以每只大鼠安静状态透析液的平均浓度为基础值，每5min作为一个监测点，用各观察点透析液乳酸浓度所占基础值的百分比反映其变化规律。

1.7 大鼠运动过程中4-CIN脑室注射及ECoG的同步记录

在乳酸干预组和对照大鼠开始运动以前，将微量注射泵与脑室埋藏注射导管连接，大鼠皮层记录电极及参考电极与多导电生理仪导联，运行RM6240多导电信号采集软件，采样频率为2 k/s，50 Hz陷波记录大鼠整个实验过程中的ECoG，待运动结束后对其恢复期连续记录50min，并保证整个恢复期大鼠处于清醒状态，避免大鼠进入睡眠状态后的ECoG影响实验结果。4-CIN溶于人工脑脊液（10mmol/L）。乳酸干预组大鼠运动开始后30min开始向脑室内注射4-CIN溶液（0．5 ul/min），持续注射30min。对照组施以相同量的人工脑脊液（aCSF）。因为大鼠的运动能力个体差异较大，为了直观的比较4-CIN对大鼠ECoG功率谱的影响，我们选取大鼠在安静状态、运动开始后60min时间内、力竭即刻和恢复期的50m in内进行了对比分析。同时，为了更直接反映ECoG功率谱总功率在运动过程中及药物注射前后的变化情况，我们采用不同状态时间点的总功率占安静时的总功率的百分比来进行统计分析。

1.8 脑的组织学鉴定

所有实验结束后，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（0．35mL/kg），4%福尔马林溶液常规灌流固定，脑组织冠状面做切片，对照大鼠脑图谱鉴定微透析探针与脑室注射管脑内位置，探针与注射管植入位置不准确的动物实验数据不予采用。

1.9 数据统计

2 结果

2.1 力竭运动过程中及恢复期大鼠脑乳酸的实时变化

因不同大鼠运动至力竭的时间个体差异较大，为了便于观察大鼠在力竭运动过程中纹状体胞外乳酸浓度的变化，将整个运动过程划分为4个阶段：安静期（0～30 min）；运动Ⅰ（30min～60min）；运动Ⅱ（力竭前60min～力竭）和恢复期（力竭～恢复90min）。从图1中可以看出大鼠脑内纹状体胞外乳酸在运动开始后15～20 min出现一个短暂的显著升高（P＜0．05），而在运动后期大鼠力竭前10min纹状体胞外乳酸浓度显著降低（P＜0．05，P＜0．01），甚至在恢复期的90 min时间内，纹状体胞外乳酸仍显著低于安静时水平（P＜0．05，P＜0．01）。

2.2 力竭运动过程中4-CIN脑室注射对大鼠ECoG功率谱总功率的影响

从表1中可以看出，aCSF对照组与乳酸干预组大鼠的ECoG功率谱总功率在药物干预前的安静状态（0～20min）和运动状态两组大鼠的ECoG功率谱总功率组间均无显著性差异（P＞0．05）。在运动开始后30min对照组大鼠脑室注射aCSF没有对其ECoG产生明显的影响，大鼠力竭运动停止后，ECoG总功率即恢复至安静时的水平。而乳酸干预组大鼠在药物注射后ECoG功率谱总功率即快速下降，在注射药物后20min点、30 min点ECoG功率谱总功率显著低于aCSF对照组（P＜0．05），恢复期10m in点4-CIN注射组大鼠ECoG功率谱总功率显著低于aCSF对照组（P＜0．05）。

表1 4-CIN对大鼠ECoG功率谱总功率的影响（n=6）Tab.1 Influence of4-CIN on the ECoG power spectrum total power of rats

2.3 4-CIN脑室注射对大鼠运动能力的影响

从图2中可以看出对照组大鼠的运动至力竭平均时间为（145．83±34．99）min，而4-CIN脑室注射组的运动至力竭平均时间为（81±19．09）min，显著低于aCSF对照组大鼠的运动能力（P＜0．01）。

3 分析与讨论

疲劳的“耗竭学说”认为，疲劳的出现是由于骨骼肌系统能量物质耗竭所致，而近年的研究发现机体的疲劳与中枢能量代谢也有密切的关系[3，11]。葡萄糖一直被认为是脑的主要能源物质，脑乳酸在脑的代谢过程中没有作用。但近年的研究发现，脑除了利用葡萄糖作为能源物质外，还可以依赖乳酸来供给能量，乳酸在星形胶质细胞和神经元的能量信息传递和脑功能活动的能量代谢偶联中发挥着极其重要的作用。随即，运动与脑乳酸代谢即成为运动生理学领域关注的热点问题[3，12-21]。然而，由于研究方法以及实验对象的差异造成研究者们对于运动疲劳与脑乳酸代谢的研究所得出的结果却存在着较大差异，既有乳酸堆积的报道[15]，也有乳酸没有产生显著变化的实验证明[13]。本研究在清醒动物运动过程中的观察结果发现大鼠在一次性的力竭运动过程中，脑内乳酸只在运动初期有短暂的升高，在运动后期、力竭即刻及恢复期都显著降低。在运动的开始阶段神经元兴奋，功能活动显著增强，激活星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭产生大量乳酸可能是导致胞外乳酸浓度短暂升高的主要原因。脑虽然可以从外周血液中摄取葡萄糖、乳酸为神经元提供能量，然而由于运动强度较大，持续时间长，脑的能量需求远远超出其从外周血液中所能摄取的能量物质的量，中枢神经系统即可能启动糖原储备系统将糖原酵解为乳酸来满足神经元的能量需求[22]，最终由于糖原的耗竭导致胞外乳酸水平显著降低。本研究结果中大鼠在运动停止后的90 min内，脑内乳酸仍保持较低的水平原因可能就是在运动停止后，其原因可能是脑虽然可以从外周血液中摄取大量的葡萄糖和乳酸，但此时这些被脑所摄取的碳水化合物被用于脑糖原的合成储备，所以在短时间内脑乳酸仍不能恢复至运动前的水平[23]。

脑内乳酸的穿梭是通过单羧酸转运体（monocarboxylate transporters，MCT）来完成的，4-CIN有效地抑制神经元的MCT对于脑内乳酸的转运，阻止神经元对乳酸的摄取和利用[6]。为了进一步证实脑乳酸在运动性疲劳过程中的作用，本文采用4-CIN在运动过程中脑室注射的方法阻断脑神经元对于乳酸的摄取和利用，观察脑内乳酸阻断对大鼠运动能力的影响。ECoG功率值反应皮层神经元信号能量的大小，间接反映中枢神经系统神经元电生理活动的活性，ECoG功率值增高说明其神经元的功能增强，反之则说明神经元的功能减弱。本实验结果中大鼠在开始运动时ECoG功率值均显著升高，说明了在运动状态下，大鼠皮层神经元的功能活动显著增强以维持躯体的运动。然而，当大鼠在运动过程中脑室注射4-CIN 20min后其功率值显著降低，提示运动过程中当乳酸在脑内的代谢受阻，乳酸不能有效地为神经元提供能量的时候，运动过程大脑皮层的电活动即显著减弱。本文采用方差分析的方法统计结果发现不同大鼠ECoG功率值在运动过程中个体差异较大，而在运动前后的安静状态则较小。分析其原因可能是因为不同动物的运动能力及皮层运动区的神经元活性的差异较大，完成相同强度运动需要的皮层神经元元的电活动功率差异较大所造成的。

实验结果提示脑乳酸对于运动过程中维持中枢神经系统高水平的电生理功能活动起着极其重要的作用。本实验对大鼠运动能力的观察结果也发现4-CIN脑室注射可以显著降低大鼠的运动能力，其原因可能是4-CIN进入脑组织后阻断了神经元对于乳酸的摄取和利用所致。虽然运动过程中脑内葡萄糖以及脑内糖原储备也可为神经神经细胞提供能量，但在运动状态下，脑神经元所主要依赖的能量底物是乳酸[3]，4-CIN导致脑内外源性和内源性的乳酸均不能参与能量代谢，直接影响到神经元其正常的电生理活动，表现为脑电功率下降、运动能力下降。因此，本实验结果再次证实乳酸在运动过程中脑的能量代谢过程中发挥着不可替代的作用，而且大鼠运动过程中脑内乳酸水平的降低是导致运动性疲劳出现、机体运动能力降低的主要原因之一。

4 结论

脑乳酸在运动性疲劳的发生过程中发挥着重要的作用，脑内乳酸代谢不足可能是导致运动性疲劳出现，机体运动能力降低的主要原因之一。

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Dynam ic Research of M echanism of Brain Lactate on Exercise-induced Fatigue

YANG Dongsheng1，2，LIU Xiaoli2，QIAO Decai2
（1．Institute of Sport Science Research，Zhejiang Technology University，Hangzhou 310014，China；2．School of PE and Sports，Beijing NormalUniversity，Beijing 100875，China）

Objective：The aim of this research is to study themechanism of brain lactate in the development of exercise-induced fatigue．Methods：Coupling ofmicrodialysis and electrochemical detection techniquewas used for the on-line analysis of extracellular lactate in rats'striatum during exhaustive exercise．Ventriclemicro-injectionmethod was applied to study the effect of 4-CIN on the exercise ability and electrocorticogram of rats．Results：Striatum extracellular lactate of rat significantly increased at the begging of exercise（P＜0．05）and it decreased significantly during the later exercise time and recovery time（P＜0．05，P＜0．01）；4-CIN can significantly reduce the power of electrocorticogram in the process of exercise（P＜0．05）and decrease the exercise time of rats（P＜0．01）．Conclusion：Brain lactate plays the important role in the development of exercise-induced fatigue．Lacking of lactatemay be one of the important reasonswhich caused the exercise-induced fatigue．

lactate；brain；rat；electrocorticogram；sport fatigue

G 804．7

A

1005-0000（2011）06-0485-04

2011-01-04；

2011-09-10；录用日期：2011-09-15

国家自然科学基金项目（项目编号：30971416；31171138）

杨东升（1978-）,男，山西朔州人，博士，讲师，研究方向为运动生理学。

1.浙江工业大学体育科学研究中心，浙江杭州310023；2.北京师范大学体育与运动学院，北京100875。